孫夢(mèng)玲，王彬，陳友明，薛暉

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱(chēng)小龍蝦，屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)（Arthropoda），甲殼綱（Crstacea），十足目（Decapoda），是目前我國(guó)養(yǎng)殖最廣的淡水螯蝦品種[1]，在我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)廣泛養(yǎng)殖，其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者的青睞。2017年江蘇省小龍蝦養(yǎng)殖面積約1 400 000×667 m2，總產(chǎn)值達(dá)450億元，在產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展壯大的同時(shí)，病害的發(fā)生成為了阻礙其發(fā)展的重要原因之一。

白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是一種具有囊膜的桿狀病毒[2]，地理分布廣、流行范圍大、傳染性強(qiáng)、發(fā)病時(shí)間短，目前尚無(wú)有效的藥物能夠控制疫情，是中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）、凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）養(yǎng)殖中的主要病原[3-4]。研究表明WSSV具有廣泛的宿主，可以感染甲殼綱十足目的大部分動(dòng)物[4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在克氏原螯蝦養(yǎng)殖中也廣泛流行，給克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

1 材料與方法

該次調(diào)查共選取金湖、泗洪、盱眙、高淳、武進(jìn)、及揚(yáng)中為病害監(jiān)測(cè)點(diǎn)及樣品采集點(diǎn)，各測(cè)報(bào)點(diǎn)定期匯報(bào)最新病情，同時(shí)實(shí)地走訪發(fā)病塘口，了解發(fā)病歷史、發(fā)病季節(jié)及發(fā)病癥狀。在每個(gè)采集點(diǎn)隨機(jī)選取養(yǎng)殖戶5戶進(jìn)行樣品采集，采樣時(shí)間為2018年4月至2018年6月，每月采集樣本1次，每批次每個(gè)養(yǎng)殖戶塘口隨機(jī)選取克氏原螯蝦10只，將活體置于保溫箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，直接取活體鰓組織約100 mg，用于PCR檢測(cè)，剩余部分收集于eppendorf管內(nèi)并編號(hào)后置于-80℃冰箱儲(chǔ)存。

Takara universial genomic DNA抽提試劑盒購(gòu)于南京浩嘉生物醫(yī)藥有限公司，PCR反應(yīng)Mix購(gòu)于南京唯贊生物科技，100 bp DNA ladder購(gòu)于南京唯贊生物科技，PCR儀為Biometra T-Gradient Thermoblock，電泳儀及凝膠成像儀為BIO-RAD，恒溫金屬浴為Bioer CHB-202，冷凍離心機(jī)為Eppendorf 5417R。

將活體取出的鰓組織混合后剪碎并稱(chēng)取0.05 g組織，參照組織DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行組織DNA提取。

檢測(cè)方法采用江蘇省水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心的對(duì)蝦白斑綜合病毒檢驗(yàn)方法。槽式PCR引物分別為：槽式第一步引物：146F1:5'-ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG-3'146R1:5'-TAA TGC GGG TGT AATGTTCTT ACG A-3’擴(kuò)增1 447 bp的片段，槽式第二步引物146F2:5'-GTA ACT GCCCCT TCC ATC TCC A-3’146R2:5'-TAC GGC AGC TGC TGC ACC TTG T-3'擴(kuò)增上述片段中的941 bp片段，內(nèi)參PCR引物：146F3:5'-TGC CTT ATC AGC TNT CGA TTG TAG-3'146R3:5'-TTC AGNTTT GCA ACC ATACTT CCC-3'擴(kuò)增十足類(lèi)動(dòng)物DNA中848 bp片段。檢測(cè)反應(yīng)體系統(tǒng)一為：Q2F（10 mM）1 uL，Q2R（10 mM）1 uL，模板 DNA 5 uL，PCR mix 25 uL，ddH2O 18 uL，總反應(yīng)體積為25 uL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10 min，后4℃保存待檢測(cè)。

取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 uL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠含量為1%（提前加入核酸染料 Gold View），電壓120 V，電泳時(shí)間為35 min，電泳結(jié)束后將凝膠置于紫外燈下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果

不同時(shí)期不同養(yǎng)殖區(qū)的克氏原螯蝦WSSV檢出率見(jiàn)表1，金湖和泗洪兩地的在4、5、6三個(gè)月內(nèi)均有WSSV檢出，并且在5月檢出率最高，泗洪達(dá)32%，金湖達(dá)24%，高淳及武進(jìn)兩地檢出率較低，僅在5月有檢出，數(shù)據(jù)分別為4%及8%，且所采集養(yǎng)殖戶塘口小龍蝦并未發(fā)病。揚(yáng)中克氏原螯蝦WSSV在采樣階段有持續(xù)檢出，但較蘇北地區(qū)檢出率低。

表1 不同時(shí)期克氏原螯蝦WSSV檢出率

3 討論

WSSV被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為需向OIE申報(bào)的疾病，在對(duì)蝦中發(fā)生時(shí)病死率高，死亡快，克氏原螯蝦在感染W(wǎng)SSV后發(fā)病較對(duì)蝦慢，病死率也較對(duì)蝦低，因此曾作為病例研究的模式生物。近年來(lái)隨著克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，苗種與產(chǎn)品流通空間的擴(kuò)展，使WSSV在克氏原螯蝦中傳播迅速，加之養(yǎng)殖戶許多不科學(xué)的養(yǎng)殖手段及部分養(yǎng)殖戶為克氏原螯蝦提供的生長(zhǎng)環(huán)境較差，由白斑病引起的死亡造成損失較大。該次流行病學(xué)調(diào)查選取蘇南及蘇北各3個(gè)養(yǎng)殖區(qū)，采集時(shí)間覆蓋克氏原螯蝦生長(zhǎng)及上市交易的主要時(shí)段，對(duì)江蘇省內(nèi)的WSSV覆蓋及發(fā)生情況進(jìn)行了初步了解。WSSV的傳播是受溫度影響的，這一點(diǎn)從檢測(cè)結(jié)果中得到印證，在5月，氣溫達(dá)到25℃以上，WSSV的檢出率明顯提高，并且開(kāi)始發(fā)生死亡，4月溫度相對(duì)較低，檢出率也低，到6月時(shí)，溫度升高，最高溫度可達(dá)到30℃，同時(shí)池塘內(nèi)龍蝦因前期售賣(mài)捕撈的原因，密度大大降低，控制WSSV的傳播與發(fā)生。就養(yǎng)殖區(qū)域看，蘇北地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積廣，產(chǎn)量高，流通量大，因此在相應(yīng)時(shí)段WSSV的檢出率要高于蘇南地區(qū)。溫度是影響病害發(fā)生的重要因素，因此在生產(chǎn)養(yǎng)殖中，做好高溫來(lái)臨前的防治工作十分必要，可以提前補(bǔ)充免疫增強(qiáng)劑，增強(qiáng)抗應(yīng)激能力。高密度大范圍的養(yǎng)殖不可避免得會(huì)發(fā)生病害，因此控制養(yǎng)殖環(huán)境，做好苗種檢疫，不用發(fā)病塘口的親蝦及種蝦，加強(qiáng)親本及苗種的檢驗(yàn)檢疫，建立SPF親本保護(hù)及苗種繁育基地，從源頭切斷WSSV的發(fā)生。