韓斐 江明鋒 冉嫆 王剛

（1. 西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041；2. 四川大學(xué)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)材料工程研究中心，成都 610064）

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，由于多肽藥物具有作用專(zhuān)一、高效等優(yōu)點(diǎn)，目前多肽類(lèi)藥物的研制和應(yīng)用已成為生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的熱點(diǎn)，其中包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、單克隆抗體和酶等［1］。然而，多肽作為藥物注射入生物體內(nèi)時(shí)存在很多問(wèn)題，如免疫原性強(qiáng)、半衰期短、酶解性強(qiáng)及溶解度較低等。其中半衰期短問(wèn)題嚴(yán)重制約了小肽類(lèi)藥物的發(fā)展，這主要是由于分子量低于腎小球過(guò)濾閾值（閾值約60-70 kD），使得血液中的藥物在通過(guò)腎臟時(shí)快速被清除，從而大大降低了多肽類(lèi)藥物的在血漿的半衰期［2］。因此，需要提高用藥的劑量以及用藥頻率來(lái)維持藥物在體內(nèi)的有效濃度，這樣給患者增添了許多苦惱。PEG 化（PEGylation）是20 世紀(jì)70 年代后期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)熱門(mén)蛋白修飾技術(shù)，PEG 是一類(lèi)高分子多聚物，目前廣泛應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)藥物或非蛋白質(zhì)藥物的修飾，可以有效地增加小肽類(lèi)藥物的流體力學(xué)體積，延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期［3-5］。但是近期的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PGE 修飾的藥物在患者長(zhǎng)期治療過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致一系列問(wèn)題，如腎臟空泡化和聚合物在體內(nèi)積累［6］，甚至有報(bào)道稱(chēng)在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了PEG 生物制品抗體［7-10］，這些都使得PEG 藥物安全性引起廣泛的關(guān)注。

PAS 蛋白修飾（PASylation）是近幾年發(fā)展起來(lái)的融合蛋白修飾的技術(shù)，在蛋白類(lèi)藥物的N 端或者C 端連接由脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）組成的序列進(jìn)行融合表達(dá)［11］。PAS 序列是親水、不帶電的生物聚合物，具有與聚乙二醇（PEG）非常相似的生物物理性質(zhì)，可以形成一個(gè)天然的非結(jié)構(gòu)多肽鏈，并且具有大的流體力學(xué)體積和較高的溶解度。與PEG 化學(xué)修飾相比，PAS 融合蛋白在細(xì)胞表面的受體攝取后會(huì)被胞內(nèi)的溶酶體蛋白酶快速降解，有效避免了在細(xì)胞中沉積。此外，PAS 序列是由3 個(gè)天然氨基酸組成的，且形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，因此適用于目前常見(jiàn)的生物表達(dá)體系，通過(guò)基因工程技術(shù)的生產(chǎn)方式可以大大減少成本［12］。目前PAS 修飾蛋白技術(shù)已被用于延長(zhǎng)各種生物制品在生物體內(nèi)的血漿半衰期，如抗體Fad 片段、生長(zhǎng)激素、酶和干擾素等。

1 PAS 序列設(shè)計(jì)

1.1 氨基酸的選擇

PEG 高聚物具有親水性高，流體力學(xué)體積較大及不帶電性的特點(diǎn)，為了使得組成的氨基酸序列具有類(lèi)似的物理特性，首先將帶電性的以及具有疏水性側(cè)鏈且疏水性較強(qiáng)的氨基酸排除，在剩下的電中性且親水能力較強(qiáng)的氨基酸中，其中天門(mén)冬氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸由于具有較強(qiáng)的趨勢(shì)形成一個(gè)有規(guī)則的結(jié)構(gòu)而被排除；組氨酸因?yàn)橛休^強(qiáng)的趨向與金屬離子相互作用而被排除［11］，所以選中的3 個(gè)氨基酸分別是脯氨酸、丙氨酸和絲氨酸。

1.2 PAS序列的順序

在確定了構(gòu)建序列的氨基酸種類(lèi)后，對(duì)Pro、Ala 和Ser 這3 個(gè)氨基酸的排列順序進(jìn)行優(yōu)化，使其所形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)與PEG 聚合物具有相似的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，并通過(guò)計(jì)算模擬其序列的混亂熵值使其達(dá)到較高水平［12］。例如，這3 個(gè)氨基酸在二級(jí)結(jié)構(gòu)上形成功能結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)應(yīng)該盡可能相互消減，設(shè)計(jì)過(guò)程中要多考慮脯氨酸氨基端的反式異構(gòu)結(jié)構(gòu)，因?yàn)榭梢栽黾诱麠l肽鏈的混亂熵值。此外，最大限度避免兩個(gè)或者兩個(gè)以上相同氨基酸的連接等，通過(guò)這些原則可以最大程度上避免α 螺旋，β 折疊等規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成［11］。

2 PAS 蛋白修飾技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

2.1 蛋白PAS修飾有望取代PEG修飾

蛋白PAS 修飾是借助于天然氨基酸Pro、Ala 和Ser 組成的序列，在結(jié)構(gòu)等物理特性方面參照PEG并通過(guò)與小分子多肽形成融合蛋白的形式而發(fā)展起來(lái)的蛋白修飾技術(shù)。PAS 修飾蛋白和PEG 蛋白聚合物具有相似的生物物理性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：在生理的條件下，兩者具有較高的可溶性，在溶液中都呈現(xiàn)出無(wú)規(guī)則卷曲的結(jié)構(gòu)。因此，可以在不影響蛋白質(zhì)功能的情況下增加其流體力學(xué)體積，從而顯著延長(zhǎng)了PAS 修飾蛋白的血漿半衰期。目前，在PAS 修飾藥物分別對(duì)多個(gè)物種（如小鼠、大鼠、豬、狗和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)）藥理活性的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，PAS 修飾的藥物除了保持PEG 修飾的優(yōu)越性外，還彌補(bǔ)了其很多不足，如生產(chǎn)成本高、生物活性損失和安全性低等問(wèn)題［13］。

2.2 生產(chǎn)成本較低

目前應(yīng)用于臨床藥物生產(chǎn)的PEG 原料價(jià)格較為昂貴，而且在蛋白質(zhì)藥物PEG 修飾過(guò)程中的偶合和純化步驟中活性損失率普遍較高［14-15］，因此大規(guī)模生產(chǎn)PEG 修飾多肽類(lèi)藥物成本昂貴，且工序較為繁瑣。相比之下，因脯氨酸、丙氨酸、絲氨酸這3 種氨基酸組合形成PAS 序列的高級(jí)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，所以適用于目前所有常見(jiàn)表達(dá)系統(tǒng)，包括哺乳動(dòng)物細(xì) 胞（CHO、HEK、COS）、 酵 母（Pichia pastoris、（Kluyveromyceslactis lactis）、大腸桿菌或革蘭氏陽(yáng)性菌等［11］，借助基因工程的手段可大大降低生產(chǎn)成本以及繁瑣的生產(chǎn)工藝。

2.3 生物活性損失小

在PEG 修飾蛋白的過(guò)程中，通過(guò)Lys 側(cè)鏈的修飾通常會(huì)降低藥物的生物活性，如PEG 修飾的干擾素（IFNα2a）和白細(xì)胞介素-1 受體拮抗劑（IL-1Ra）等，與未經(jīng)修飾相比，只保留了10%的活性［16-17］。目前，還未見(jiàn)通過(guò)PAS 修飾的蛋白藥物藥理活性損失的報(bào)道。

2.4 較高的溶解度

通過(guò)基因編碼的PAS 序列在多種情況下都是單分散性的，有相關(guān)實(shí)驗(yàn)對(duì)相同分子量大小的PAS 和PEG 修飾的同種蛋白聚合物進(jìn)行了物理性質(zhì)比較，發(fā)現(xiàn)PAS 融合蛋白的黏度較低，比PEG 修飾的蛋白展現(xiàn)出更高的親水性及溶解度［18］。這大大增加臨床上注射給藥方式的效率。同時(shí)，在大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到，通過(guò)皮下或肌肉注射的方式，PAS 修飾藥物展現(xiàn)出了更高的生物利用度［12，19］。

2.5 生物安全性

早期的研究認(rèn)為，PEG 是通過(guò)保護(hù)非本體蛋白質(zhì)不受機(jī)體中的抗體或免疫細(xì)胞監(jiān)管來(lái)降低藥物免疫原性的，一直認(rèn)為是生物惰性材料［20］。然而隨著越來(lái)越多的PEG 化藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用，關(guān)于患者體內(nèi)抗PEG 抗體的產(chǎn)生并造成藥效損失的報(bào)道不斷增多［7-10］，加之PEG 是一種高聚化學(xué)分子，生物降解性較低，長(zhǎng)期服用后會(huì)導(dǎo)致PEG 在體內(nèi)的沉積，引起細(xì)胞空泡化，對(duì)組織造成不可估量的損傷。最近，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）對(duì)9 種已上市PEG 修飾蛋白藥物進(jìn)行審查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Omontys、Cimzia、Macugen、Krystexxa 和Somavert 這5 種藥物可以促使細(xì)胞空泡的形成，還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中空泡出現(xiàn)的頻率與PEG 在體內(nèi)的累積劑量成正相關(guān)［6］。例如，PEG 修飾的Fab 片段cimzia，按照每次400 mg 的劑量，兩周給藥一次的頻率，一段時(shí)間后分別在肝內(nèi)巨噬細(xì)胞，庫(kù)普弗細(xì)胞以及脾內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞等吞噬細(xì)胞中出現(xiàn)PEG 沉積。此外，在腎小管上皮細(xì)胞和脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中也觀察到了空泡的形成［21-22］。歐洲藥品管理局（EMA）也下達(dá)了針對(duì)兒童人群謹(jǐn)慎使用PEG 修飾藥物的指令［23］。相比之下，P、A、S 這3 個(gè)氨基酸自身屬于生物體的天然物質(zhì)，通過(guò)PAS 修飾的小分子藥物在血漿中不具有免疫原性且穩(wěn)定性強(qiáng)，重要的是在相關(guān)細(xì)胞攝取后，它們很快被細(xì)胞內(nèi)溶酶體蛋白酶降解，有效防止了在細(xì)胞的空泡化。

3 PAS 蛋白修飾技術(shù)的應(yīng)用

3.1 蛋白質(zhì)藥物的修飾

目前，PAS 技術(shù)已成功應(yīng)用于很多功能性蛋白的修飾，包括人生長(zhǎng)激素（hGH）［24］、IFN-α2b 抗體片段［11］、IFN-β1b 抗體片段［25］、瘦素［19，26］、紅細(xì)胞生成素（EPO）［27］和白細(xì)胞介素-1 受體拮抗劑（IL-1Ra）［12］等，這些修飾后的蛋白均顯著增加了流體力學(xué)體積，延長(zhǎng)了其血漿半衰期，提高了多肽藥物的藥理活性。

3.2 Fad抗體片段的修飾

位于單克隆抗體（mAbs）上的抗原結(jié)合片段（Fabs），因其可以有效的識(shí)別癌癥的一些標(biāo)志性的抗原，并成功應(yīng)用于一些腫瘤的治療中［28-29］，所以是目前增長(zhǎng)最快的一類(lèi)生物治療藥物。其中有一些帶有放射性的Fabs 免疫偶聯(lián)物，如Zevalin，在臨床治療中的腫瘤靶向性方面具有廣闊的應(yīng)用前景，但是由于它們體積較小，腎臟清除速度很快（在人體內(nèi)為數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)），通常會(huì)導(dǎo)致示蹤劑在靶向腫瘤組織的積累不充分，從而導(dǎo)致腫瘤成像不均勻且具有較高的背景信號(hào)等缺點(diǎn)［30-32］。而經(jīng)PAS 修飾過(guò)后的αher2-Fab 抗體片段，增加了在體內(nèi)的半衰期，優(yōu)化后腫瘤成像中信號(hào)與背景成像比例提高到原來(lái)的12.2 倍［33］。從高效和安全性的角度來(lái)考慮，PAS對(duì)抗體片段的修飾在腫瘤成像和診斷的應(yīng)用中有著廣闊的前景和巨大的應(yīng)用價(jià)值。

3.3 納米載體的修飾

有報(bào)道稱(chēng)，用PAS 修飾的鐵蛋白做納米載體并成功靶向遞送了阿霉素［34］。鐵蛋白是一種機(jī)體內(nèi)貯存鐵的可溶組織蛋白，可以選擇性地結(jié)合到轉(zhuǎn)鐵蛋白受體I 上［35］。鐵蛋白N 端與40 個(gè)殘基的PAS 序列相連組成的融合鐵蛋白，與未經(jīng)修飾的鐵蛋白相比，提高了其穩(wěn)定性和溶解性，鐵蛋白裝載藥物的回收率從50%提高到了95%。同時(shí)，PAS 序列增加了蛋白的產(chǎn)率，每1 L 大腸桿菌培養(yǎng)物的產(chǎn)量增加約100 mg。此外，還發(fā)現(xiàn)PAS 修飾的鐵蛋白對(duì)阿霉素的載藥量增加了3 倍，并極大程度提高了穩(wěn)定性，在4℃條件下，PBS 中儲(chǔ)存3 個(gè)月后無(wú)沉淀析出，藥物泄漏量?jī)H為10%，而在未經(jīng)修飾的鐵蛋白中，在僅兩周后就可以達(dá)到50%泄漏量［34］，可見(jiàn)PAS 對(duì)納米載體的修飾可以大大增加其穩(wěn)定性。

3.4 融合蛋白linker

由于P、A、S 這3 個(gè)氨基酸及其序列順序可以形成一個(gè)無(wú)序卷曲的結(jié)構(gòu)，在二級(jí)機(jī)構(gòu)上避免了功能性結(jié)構(gòu)區(qū)域的出現(xiàn)，從而最大限度保持了本體蛋白功能的完整性［11］。因此可作為linker 用于多個(gè)功能蛋白的連接，這樣不但可以作為活性增強(qiáng)的生物技術(shù)催化劑用于工業(yè)化生產(chǎn)，而且可以用于一些復(fù)雜疾病的治療。例如，通過(guò)PAS 序列（60）將左旋二酮還原酶與ω-氨基轉(zhuǎn)移酶連接進(jìn)行融合表達(dá)，雖然這種融合肽與單個(gè)生物的催化酶活性相比略有降低，但是在異山梨酯等工業(yè)相關(guān)氨基醇的制備過(guò)程中的氧化耦合以及轉(zhuǎn)氨化反應(yīng)中，與平時(shí)工業(yè)生產(chǎn)中所用的分離酶混合物相比，其活性得到顯著的增強(qiáng)［36］。除此以外，GLP-1 類(lèi)似物exextin-4 通過(guò)PAS（600）序列與胃腸激素肽YY3-36 融合表達(dá)，這種融合肽除了保留這兩種肽各自的活性外，還將其在小鼠的血漿半衰期延長(zhǎng)到16 h。目前，在慢性代謝紊亂、糖尿病及肥胖癥等復(fù)雜疾病中，單一藥物治療的效果往往不盡人意，相比之下，聯(lián)合作用藥物的治療有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)［37］。通過(guò)PAS 序列連接，并借助生物技術(shù)工程的手段生產(chǎn)多功能的融合肽具有高效、廉價(jià)和簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。目前，PAS 序列作為linker用于多個(gè)功能蛋白的連接還在不斷地被探索，無(wú)論對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)還是藥物研發(fā)都有著巨大的潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

3.5 其他多肽血漿半衰期延長(zhǎng)的修飾技術(shù)

除了基于不帶電性的PAS 多肽蛋白修飾技術(shù)之外，近年來(lái)還出現(xiàn)了與陰離子氨基酸組合而成的聚合物進(jìn)行融合表達(dá)，由于腎基底膜帶負(fù)電荷，從而通過(guò)與腎基底膜形成相互排斥的作用力來(lái)減緩腎代謝速率，增加藥物在血漿中的半衰期［38］。例如，膠狀蛋白質(zhì)聚合物（GLK），它是由P、S、G、N、Q、E、K、A 等陰離子氨基酸組合而成的短肽鏈，粒細(xì)胞集落刺激因子（GCSF）在N-端結(jié)合116 個(gè)殘基的GLK 短肽后，其融合肽產(chǎn)物通過(guò)皮下注射的給藥方式，發(fā)現(xiàn)經(jīng)修飾過(guò)的GCSF 在小鼠體內(nèi)血漿半衰期增加到5.7 倍［39］。目前已知GLK 融合蛋白只適用于畢赤酵母，在大腸桿菌中的產(chǎn)量非常低，其他表達(dá)系統(tǒng)中還未見(jiàn)報(bào)道［40］。XTEN 也是整體帶負(fù)電荷且應(yīng)用較廣泛的非結(jié)構(gòu)多肽，XTEN 多肽由P、E、S、T、A、G 等氨基酸組成，目前已成功應(yīng)用于人體生長(zhǎng)激素［41］、凝血因子VIII、IX［42］、胰高血糖素［43］、胰高血糖素樣肽類(lèi)似物［44］及exenatide［42］等。例如，在人體生長(zhǎng)激素連接一定長(zhǎng)度的XTEN 多肽，通過(guò)皮下注射后可將藥物半衰期延長(zhǎng)到100 個(gè)小時(shí)，是未修飾人體生長(zhǎng)激素的55 倍［41］。在胰高血糖素的C-端連接144 個(gè)殘基的XTEN 多肽后，同樣是通過(guò)皮下注射的方式給食蟹猴進(jìn)藥，將半衰期延長(zhǎng)到6 h［43］。但是，由于XTEN 序列本身帶有較高的負(fù)電荷，在與腎基底膜產(chǎn)生相互排斥的同時(shí)，也會(huì)改變被修飾蛋白的帶電性，從而導(dǎo)致與其細(xì)胞表面受體的親和力下降，藥物的藥理活性損失較大。例如，經(jīng)XTEN 修飾過(guò)后的胰高血糖素只保留了最初活性的15%［43］。此外，人血清蛋白（HSA）是人體血液中含量最高的單一蛋白，具有無(wú)免疫原型，人體相容性好，血漿半衰期較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因此融合后可延長(zhǎng)藥物半衰期，目前公布的臨床結(jié)果表明HSA-IFNα融合蛋白Albuferon 的半衰期長(zhǎng)可延長(zhǎng)到145 h，并進(jìn)入了II 期臨床研究［45］。但由于人血清蛋白的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，其制備純化工藝較為繁瑣且活性損失較大，這一缺點(diǎn)限制了其在市場(chǎng)的廣泛流行。另外，多聚唾液酸是N-乙酰神經(jīng)氨酸的多聚分子，可用作蛋白藥物的緩釋材料，由于多聚唾液酸本身的功能，因此在神經(jīng)修復(fù)，神經(jīng)創(chuàng)傷愈合等材料的修飾中具有廣闊的前景［46］。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，PAS 修飾是一項(xiàng)比較新的技術(shù)。目前，已成功應(yīng)用于多種功能肽的修飾，有效提高被修飾蛋白在血漿中的半衰期，增加藥理活性。這種借助于天然氨基酸，形成具有與PEG 聚合物類(lèi)似結(jié)構(gòu)的蛋白修飾的方法，目前還在被進(jìn)一步探索，并被認(rèn)為是最有前景的可以替代聚乙二醇化蛋白修飾技術(shù)。與其他基于多肽的氨基酸修飾技術(shù)相比，PAS 序列的不帶電性和形成無(wú)序環(huán)狀結(jié)構(gòu)等特性方面與PEG修飾最為相似，因此具有幾乎相同的生物物理特性。而PAS 修飾與PEG 修飾相比，前者可借助現(xiàn)代生物工程技術(shù)進(jìn)行融合表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)；與PEG 的化學(xué)偶聯(lián)修飾相比，PAS 修飾技術(shù)在生產(chǎn)和應(yīng)用方面變得簡(jiǎn)化和廉價(jià)，更重要的是，天然氨基酸成分在體內(nèi)的無(wú)痕跡代謝也為PAS 修飾藥物應(yīng)用提供了一個(gè)更好的前景。

目前，PAS 融合序列已被應(yīng)用到蛋白修飾的多個(gè)領(lǐng)域。PAS 修飾的多肽類(lèi)藥物在體內(nèi)成功增加了其血漿半衰期，提高藥物的藥理活性，并被廣泛的應(yīng)用于多種生物制劑。同時(shí)，PAS 修飾技術(shù)在體內(nèi)腫瘤成像和藥物傳遞系統(tǒng)中也有著極高的應(yīng)用價(jià)值，如PAS 修飾后的抗原結(jié)合片段，可以在沒(méi)有相關(guān)副作用的前提下優(yōu)化了腫瘤成像，經(jīng)PAS 修飾過(guò)后的鐵蛋白納米載體，載藥量及其穩(wěn)定性都大幅度提升。此外，PAS 序列作為linker 被應(yīng)用在聯(lián)合作用藥物中，如雙功能肽，這樣不但簡(jiǎn)化制造過(guò)程，降低了成本，又延長(zhǎng)了體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，因此PAS 序列在多功能融合蛋白的是生產(chǎn)中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。綜上，隨著PEG 修飾藥物的弊端不斷被發(fā)現(xiàn)，尋找PEG 化以外的更為安全有效的方法是非常有必要的。而PAS修飾在彌補(bǔ)了PEG 修飾不足的同時(shí)，在許多方面都展現(xiàn)出與PEG 化有著近乎相同的特點(diǎn)，與其他多肽修飾技術(shù)相比，其簡(jiǎn)單的制備工藝也非常有利于大規(guī)模的生產(chǎn)，同時(shí)應(yīng)用也較為廣泛。因此，PAS 修飾技術(shù)對(duì)小肽藥物的發(fā)展有著巨大的潛力。但PAS修飾技術(shù)是一項(xiàng)新興的技術(shù)，對(duì)其探索還未成熟，我們需要進(jìn)一步了解PAS 的長(zhǎng)度與被修飾蛋白的關(guān)系以及PAS 這3 個(gè)氨基酸分別在被修飾的多肽中所起的功能作用，這樣可以在小分子藥物的發(fā)展中發(fā)揮出更大的優(yōu)勢(shì)。