張微 李志新 付春江 劉衛(wèi)平

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院，齊齊哈爾 161600）

馬鈴薯 S 病毒（Potato virus S，PVS）也稱為馬鈴薯潛隱病毒，該病毒主要通過接觸和蚜蟲帶毒傳播，感染此病毒可使馬鈴薯質(zhì)量和產(chǎn)量嚴(yán)重降低。該病毒分布范圍十分廣泛，在所有馬鈴薯種植區(qū)都發(fā)生。PVS 單獨(dú)侵染馬鈴薯，產(chǎn)生的癥狀較輕微，甚至不表現(xiàn)出癥狀，產(chǎn)量降低10%-20%［1］。在田間PVS 常與其他病毒混合侵染，造成嚴(yán)重危害［2］。目前，對(duì)PVS 病的防治，主要是通過篩選種植抗病品種，利用莖尖脫毒方法進(jìn)行脫毒苗的繁育，生產(chǎn)脫毒種薯等。PVS 的脫毒很困難，因此通過病毒檢測(cè)技術(shù)，對(duì)種薯PVS 進(jìn)行快速、靈敏檢測(cè)對(duì)生產(chǎn)高質(zhì)量種薯是十分必要的。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法包括電子顯微鏡、DAS-ELISA 和PCR 等［3-5］，但此類方法在生產(chǎn)應(yīng)用中存在一定的局限性［6］。膠體金免疫層析技術(shù)（Goldimmunochromatography assay，GICA） 是 利用免疫層析原理，將膠體金標(biāo)記、免疫檢測(cè)、層析分析、單（多）克隆抗體和新材料等結(jié)合在一起的技術(shù)，具有操作簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、無須專業(yè)技術(shù)人員與特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)［7］，在醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物檢疫、食品安全監(jiān)督等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［8-11］。在馬鈴薯上，魏梅生等已研制出馬鈴薯X 病毒和馬鈴薯Y 病毒膠體金檢測(cè)試紙條［12］。但關(guān)于PVS 快速檢測(cè)試紙條的研究未見報(bào)道，本研究制備具有使用簡便、反應(yīng)靈敏等特點(diǎn)的PVS 檢測(cè)試紙條，以適應(yīng)基層工作的實(shí)際需求。

1 材料與方法

1.1 材料

PVS，馬 鈴 薯X 病 毒（Potato X virus，PVX）、馬鈴薯Y 病毒（Potato Y virus，PVY）、馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus，PLRV），馬鈴薯M 病毒（Potato M virus，PVM），馬 鈴 薯A 病 毒（Potato A virus，PVA）毒原均為本實(shí)驗(yàn)室保存。田間供試馬鈴薯品種為“克新13 號(hào)”。

PVS 羊源多克隆抗體購買于美國Agida 公司。兔抗羊抗體購北京百奧萊博科技有限公司，氯金酸購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。檸檬酸三鈉、牛血清白蛋白購自哈爾濱欣科瑞有限公司。硝酸纖維素膜（Nitrocellulose membrane，NC 膜）、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水紙、支持板、三維大平面點(diǎn)膜噴金儀、裁條機(jī)、微電腦自動(dòng)斬切機(jī)均購自上海金標(biāo)生物科技有限公司。DAS-ELISA 檢測(cè)試劑盒購買于美國Agida 公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 膠體金的制備、鑒定 采用氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。取297 mL ddH2O 于圓底燒瓶中，加入3 mL 1% HAuCl4·4H2O 混勻。將圓底燒瓶置于電熱套式恒溫器中，加入干凈攪拌子，低速攪拌加熱至沸騰，迅速一次性加入3 mL 1% 檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，觀察顏色變化。由淺黃色→黑色→紫色→紫紅色，當(dāng)完全轉(zhuǎn)變成紅色時(shí)，繼續(xù)煮沸5 min 后停止加熱，補(bǔ)水至原體積。將燒制的膠體金溶液用蛋白核酸分析儀（Gene Spec V，日本日立）進(jìn)行全波長掃描鑒定，并置于透射電鏡（H7650，日本日立）下觀察，拍照。

1.2.2 免疫膠體金試紙條制備工藝優(yōu)化

1.2.2.1 金標(biāo)墊 主要對(duì)金標(biāo)抗體的標(biāo)記量，反應(yīng)pH 值，封閉時(shí)間、離心時(shí)間、復(fù)溶液使用量等進(jìn)行優(yōu)化。取6 支干凈的1.5 mL 離心管，分別加入1 mL膠體金，然后分別加入5 μL 1 mg/mL PVS 抗體，再加入1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL、6 μL 0.2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH，混勻后室溫靜置反應(yīng)30 min，觀察顏色變化。根據(jù)顏色和沉淀量判定免疫膠體金標(biāo)記抗體的最適pH。另取8 支干凈的1.5 mL 離心管，分別加入1 mL 膠體金，然后分別加入1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL、8 μL 1 mg/mL PVS抗體，再加入2 μL 0.2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH，混勻后室溫靜置反應(yīng)30 min，觀察顏色變化。根據(jù)顏色和沉淀量判定免疫膠體金標(biāo)記抗體的最適抗體量。標(biāo)記了膠體金后的抗體加入10% BSA 100 μL 設(shè)置不同時(shí)間，分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min 進(jìn)行封閉，選擇不同離心時(shí)間，分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min 進(jìn)行離心，留沉淀?xiàng)壣锨?，用?fù)溶液復(fù)溶沉淀至合適的比例，用噴金儀器設(shè)置不同的噴金量，分別為5 μL/cm、6 μL/cm、7 μL/cm、8 μL/cm、9 μL/cm、10 μL/cm 噴在玻璃纖維紙上，制作金標(biāo)墊。

1.2.2.2 檢測(cè)線和質(zhì)控線 將PVS 抗體用超濾管（Millipore，10 kD）濃縮至1.0 mg/mL，將硝酸纖維素膜（NC 膜）固定貼合于支持板上，使用三維平面點(diǎn)膜噴金儀，T 線劃膜量設(shè)置為0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL 將抗體劃線于NC 膜上，作為檢測(cè)線（Testline，T 線）。用0.02 mol/L 磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）將羊抗兔抗體稀釋至1.0 mg/mL，C線劃膜量設(shè)置為0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL 分別劃線于NC 膜上，作為質(zhì)控線（Controlline，C 線），37℃烘干4 h 以上。

1.2.3 試紙條的組裝 將樣品墊，金標(biāo)墊，吸水紙組裝到附有NC 膜的支持板上，然后用切條機(jī)切割成3.5 mm 寬的試紙條。

1.2.4 試紙條的檢測(cè)方法與結(jié)果判讀 將帶有膠體金復(fù)合物的一端插入檢測(cè)樣品液中，2 min 左右判斷結(jié)果。若試紙條僅C線出現(xiàn)紫紅色線而T線未顯色，結(jié)果為陰性；若試紙條上C線和T線均出現(xiàn)紫紅色，結(jié)果為陽性；若試紙條C線和T線都沒有顯色，則說明此試紙條已經(jīng)失效，結(jié)果無效。

1.2.5 試紙條的質(zhì)量檢測(cè)

1.2.5.1 特異性測(cè)試 分別將PVS、PVX、PVY、PLRV、PVM 和PVA 陽性材料用2 mL 的PBS 緩沖液混勻，制成樣品檢測(cè)液，將制備好的試紙條置于樣品中檢測(cè)，每種病毒重復(fù)檢測(cè)3 次。

1.2.5.2 靈敏度測(cè)試 取PVS 陽性樣品進(jìn)行倍比稀釋獲得10、102、103、104和105倍的樣品稀釋液，分別用試紙條進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。

1.2.5.3 馬鈴薯樣品檢測(cè) 從田間采集馬鈴薯葉片54 份，按1∶10（W/V）加入PBS 緩沖液研磨成漿，為檢測(cè)樣品。首先采用試紙條檢測(cè)，再通過DASELISA，按照試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測(cè)，若樣品孔顯現(xiàn)黃色，結(jié)果為陽性，若樣品孔呈現(xiàn)無色透明，結(jié)果為陰性。將兩種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.5.4 穩(wěn)定性測(cè)試 將試紙條放在有干燥劑的鋁箔袋中，密封保存在 4℃冰箱中；密封保存在室溫下；敞開保存在室溫下；分別設(shè)置不同保存時(shí)間，檢測(cè)試紙條有效性。

2 結(jié)果

2.1 膠體金顆粒

制備好的膠體金在紫外波長524 nm 處有最大吸收峰，其金顆粒分布均勻，形狀為球形或橢球形，直徑大小20-30 nm（圖1）。

2.2 膠體金試紙條制備條件優(yōu)化

經(jīng)過試驗(yàn)，制備金標(biāo)抗體的最佳反應(yīng)條件為加入0.2 mol/L K2CO34 μL 調(diào)節(jié)PH，PVS 抗體加入量為4 μL，封閉時(shí)間為30 min，離心時(shí)間30 min，100 μL 復(fù)溶液復(fù)溶沉淀。膠體金標(biāo)記抗體噴涂量為6 μL/cm，T 線PVS 抗體濃度為1.0 mg/mL，C 線羊抗兔抗體濃度為1.0 mg/mL，T 線與C 線劃膜量均為0.8 μL/cm。

圖1 膠體金形態(tài)

2.3 試紙條特異性

試紙條對(duì)PVS 陽性樣品的檢測(cè)結(jié)果為陽性，對(duì)PVX、PVY、PLRV、PVM 和PVA 的陽性樣品的檢測(cè)結(jié)果為陰性，說明本試紙條具有非常好的特異性（圖2）。

圖2 試紙條對(duì)6 種病毒的特異性檢測(cè)

2.4 試紙條靈敏度

試紙條對(duì)稀釋1、10、102、103、104和105倍的帶有PVS 的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)試紙條可檢測(cè)出稀釋至104倍的PVS 汁液。

2.5 試紙條與DAS-ELISA檢測(cè)樣品的一致性分析

從田間采集馬鈴薯葉片54 份，經(jīng)試紙條檢測(cè)，結(jié)果5 份為陽性，49 份為陰性，再用DAS-ELISA 方法確認(rèn)，兩者結(jié)果相符（圖4）。

2.6 試紙條穩(wěn)定性

圖3 試紙條對(duì)帶有PVS 汁液的馬鈴薯樣本靈敏度檢測(cè)

將試紙條放在有干燥劑的鋁箔袋中密封，放在4℃冰箱中保存，有效期可達(dá)180 d，能夠保持原來檢測(cè)的靈敏度；試紙條密封后，室溫保存，有效期大于60 d，檢測(cè)靈敏度有所下降；試紙條在室溫下敞開保存，15 d 就失去了檢測(cè)能力。說明在適當(dāng)條件下保存，本試紙條具有較好的穩(wěn)定性（圖5）。

3 討論

圖4 54 份田間采集馬鈴薯樣品檢測(cè)結(jié)果

圖5 試紙條穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

隨著我國馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的推進(jìn)，馬鈴薯的質(zhì)量與產(chǎn)量問題越來越受到關(guān)注與重視，我國是馬鈴薯生產(chǎn)大國，種植面積和總產(chǎn)量均占世界之首，但是，我國馬鈴薯單產(chǎn)水平較低。造成馬鈴薯單產(chǎn)低的一部分原因就是由馬鈴薯病毒病引起的。種植帶有病毒病的馬鈴薯，種薯逐年就會(huì)發(fā)生嚴(yán)重退化，使得馬鈴薯質(zhì)量差，產(chǎn)量低。為了減少馬鈴薯種薯的帶毒率，對(duì)馬鈴薯種薯進(jìn)行病毒檢測(cè)是防病毒的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在我國，危害馬鈴薯的主要病毒有6 種，其中，PVS 是主要病毒之一。目前，對(duì)PVS 的檢測(cè)，傳統(tǒng)的方法就是DAS-ELISA，RT-PCR 方法也逐漸開始通用，但這2 種方法均需要在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)過程繁瑣，需要專業(yè)的技術(shù)人員操作完成，檢測(cè)時(shí)間較長，并不適宜大田對(duì)PVS 病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)與普遍應(yīng)用。很多馬鈴薯種植企業(yè)和大戶不具備實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的條件，建立一種使用簡便，反應(yīng)快速的針對(duì)PVS 的檢測(cè)方法，是基層開展對(duì)馬鈴薯PVS 病檢測(cè)的迫切需求。

本試驗(yàn)的目的是建立PVS 膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)的方法，通過優(yōu)化試紙條的制備條件，研制出馬鈴薯S 病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。經(jīng)過田間取樣測(cè)試，本試紙條與DAS-ELISA 對(duì)PVS 的檢測(cè)結(jié)果完全吻合，說明本試紙條準(zhǔn)確性較高。已有研究表明檢測(cè)PVX 和PVY 的試紙條檢測(cè)樣品的反應(yīng)時(shí)間在10 min 之內(nèi)，低溫保存時(shí)間大于90 d，室溫保存時(shí)間大于30 d［12］。本試紙條檢測(cè)反應(yīng)快捷，2 min 左右就能判斷結(jié)果，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間。低溫保存時(shí)間超過180 d，室溫保存時(shí)間可達(dá)60 d，試紙條的穩(wěn)定性顯著提高。雖然試紙條在檢測(cè)靈敏度上，不如RT-PCR 方法，但是可以達(dá)到對(duì)病毒種類的定性篩選，對(duì)于田間病害的調(diào)查和試驗(yàn)條件差的企業(yè)具有良好應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

該檢測(cè)方法具有使用簡單方便、檢測(cè)快捷、適用性廣、特異性和靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)。作為一種快速篩查的手段，可用于廣大基層單位開展馬鈴薯S 病毒的檢測(cè)，為脫毒種薯的定級(jí)、病毒的防控提供技術(shù)支持。能夠幫助解決種薯質(zhì)量差、產(chǎn)量低等問題，具有廣闊的市場(chǎng)前景。