王柳月 李慧美 馬夢(mèng)琪 梁明星 賀如陽(yáng) 陳華波

（湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，襄陽(yáng) 441053）

定點(diǎn)突變是研究基因功能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的常用方法，目前主要使用PCR 介導(dǎo)的突變引入技術(shù)。PCR 即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種在體外迅速擴(kuò)增特定目標(biāo)DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)［1-2］。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的重疊延伸PCR（Overlap extension PCR，OE-PCR）是基因定點(diǎn)突變的主要方法［3-5］。整個(gè)OE-PCR 需要4 條引物，兩輪共3 次PCR 反應(yīng)，其繁瑣的流程一直為科研工作者所詬?。?-8］。近年來(lái)陸續(xù)發(fā)展出新的定點(diǎn)突變解決方案，主要有滾環(huán)擴(kuò)增法與大引物PCR 法［9］，據(jù)稱能簡(jiǎn)化流程，提高突變效率。也有研究者認(rèn)為這兩種方法各有弊端，如滾環(huán)擴(kuò)增法容易引入新的非預(yù)期突變［10］，而大引物PCR 法始終無(wú)法徹底避免對(duì)原始基因的擴(kuò)增［11］。因此，大多數(shù)科研工作者仍傾向于使用OE-PCR 法制作定點(diǎn)突變，并不斷提出優(yōu)化方案以期提升工作效率。如有人提出平行模板法可以避免原始基因的擴(kuò)增，于是可在同一個(gè)小管內(nèi)完成對(duì)基因突變體的擴(kuò)增［12］。

結(jié)合實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)OE-PCR 定點(diǎn)突變時(shí)效率不穩(wěn)定，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)化之后的克隆形成數(shù)較少，克隆陽(yáng)性率偏低。另一個(gè)較為普遍的現(xiàn)象是當(dāng)把基因從一個(gè)載體中酶切出來(lái)直接連入另一個(gè)載體時(shí)，轉(zhuǎn)化形成的克隆數(shù)較多，檢測(cè)陽(yáng)性率較高（幾乎100%）。而克隆一個(gè)新基因或制作一個(gè)定點(diǎn)突變時(shí)，轉(zhuǎn)化形成的克隆數(shù)較少，檢測(cè)陽(yáng)性率也往往不高。適當(dāng)增加酶濃度，或延長(zhǎng)酶切時(shí)間有助于增加克隆形成數(shù)和陽(yáng)性率，但始終無(wú)法達(dá)到前者的效果。兩者的主要區(qū)別在于前者酶切PCR 產(chǎn)物時(shí)切點(diǎn)往往位于DNA 末端，而后者酶切質(zhì)粒時(shí)切點(diǎn)位于DNA 中間。大多數(shù)限制性內(nèi)切酶都不能作用于DNA 頂端序列，因此在設(shè)計(jì)引物時(shí)會(huì)在酶切位點(diǎn)外側(cè)增加1-3 個(gè)“保護(hù)堿基”，盡管如此其酶切效率往往只能達(dá)到最大值的20%-50%.據(jù)此推測(cè)靠近PCR 產(chǎn)物末端的低效限制性酶切是制約基因克隆和定點(diǎn)突變效率的主要原因。據(jù)此，我們提出旁側(cè)引物法以期改善定點(diǎn)突變效率。即將常規(guī)OE-PCR 上、下游引物匹配位點(diǎn)由基因兩端外延50-100 bp，適當(dāng)增加第二輪PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度，使目標(biāo)基因兩側(cè)的酶切位點(diǎn)遠(yuǎn)離DNA 末端，從而提高隨后的酶切效率。

周期蛋白依賴性激酶4（Cyclin-dependent kinase 4，CDK4）是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)基因［13-14］，它與cyclin D1以復(fù)合物的形式共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1/S 轉(zhuǎn)換［15-16］。CDK4_D158N 是其重要的激酶活性缺失突變體，常用于CDK4功能研究［17］。以制作CDK4_D158N 為例，采用常規(guī)引物與旁側(cè)引物法并行OEPCR 操作，發(fā)現(xiàn)旁側(cè)引物法極大地提高了基因定點(diǎn)突變的克隆形成數(shù)與突變成功率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 感受態(tài)大腸桿菌Trans5α Chemically Competent Cell（CD201-01）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pEGFP_C2（Catalog#6083-1，Clontech），pcDNA3.1（Catalog no. V800-20，Invitrogen）及CDK4基因相關(guān)質(zhì)粒由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張傳茂教授饋贈(zèng)。

1.1.2 試 劑 2×PCR Reagent（KT207） 購(gòu) 自 天根生化科技（北京）有限公司；PyrobestTMDNA Polymerase（R005A），DNA Ligation Kit Ver.2.1（6002）購(gòu)自Takara 寶生物工程（大連）有限公司；內(nèi)切酶EcoR I（R0101V）、SalI（R0138V）購(gòu)自NEB 紐英倫生物技術(shù)北京有限公司；DNA 快速回收/純化試劑盒（NEP013-2）購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒（D0003）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 旁側(cè)引物序列參考Invitrogen 中國(guó)測(cè)序通用引物序列（http：//www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/china/common-vector-primer-list.pdf），其他引物采用Primer Premier 5. 0 軟件設(shè)計(jì)，相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，經(jīng)PAGE 純化。

表1 引物信息表

1.2.2 PCR 擴(kuò)增目標(biāo)基因及陽(yáng)性菌落檢測(cè) 擴(kuò)增目標(biāo)基因采用高保真PyrobestTMDNA Polymerase，第一輪PCR 方案：2 μL 10×buffer，1.2 μL dNTP，0.2 μL primer 1，0.2 μL primer 2，0.2 μL 酶，0.1 μL（10 ng）質(zhì)粒，補(bǔ)水至20 μL；第二輪PCR 方案：2 μL 10×buffer，2 μL dNTP，0.2 μL primer 1，0.2 μL primer 2，0.2 μL 酶，0.5 μL 上游片段回收物，0.5 μL下游片段回收物，補(bǔ)水至20 μL；運(yùn)行程序皆為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，30 循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收至20 μL ddH2O 中。用PCR 法檢測(cè)陽(yáng)性菌落時(shí)選用快速2×PCR Reagent，方案：5 μL 2×Taq，0.1 μL primer 1，0.1 μL primer 2，0.8 μL 細(xì)菌培養(yǎng)物，補(bǔ)水至10 μL；擴(kuò)增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 45 s，30 循環(huán)；72℃ 5 min。

1.2.3 基因克隆與序列分析 取5 μL 含點(diǎn)突變的目的基因回收物，加2 μL 10×buffer，0.5 μLEcoRI，0.5 μL，SalI，補(bǔ)水至20 μL，37℃孵育一定時(shí)間；取pEGFP_C2 質(zhì)粒1 μg，采取上述同樣方式酶切1 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后回收至20 μL ddH2O 中。用DNA Ligation Kit Ver.2.1 連接：載體0.5 μL，DNA片段4.5 μL，solution I 5 μL 混合，16℃孵育30 min。連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，用卡那霉素固體培養(yǎng)基篩選，結(jié)合PCR 檢測(cè)陽(yáng)性菌落。對(duì)相應(yīng)PCR 產(chǎn)物回收或陽(yáng)性菌落小量提取質(zhì)粒后進(jìn)行序列測(cè)定，序列測(cè)定采用ABI3730 系列測(cè)序儀，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 平行模板法無(wú)法避免原始基因的擴(kuò)增

平行模板法即選用兩個(gè)含同一目標(biāo)基因的不同質(zhì)粒作為模板，在這兩個(gè)質(zhì)粒上分別選一段序列作為引物［18］，支持者認(rèn)為“當(dāng)兩種模板和兩條外側(cè)引物同時(shí)存在于一個(gè)反應(yīng)管時(shí)，可以完全避免對(duì)野生型目的基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增［12］，只有在突變引物存在的情況下才能擴(kuò)增出產(chǎn)物，因此目標(biāo)產(chǎn)物一定含有預(yù)期定點(diǎn)突變。為檢測(cè)上述理論，選用pEGFP_C2-CDK4與pcDNA3.1-CDK4兩種質(zhì)粒作為平行模板，選用pcDNA3.1 多克隆位點(diǎn)（Multiple cloning site，MCS）上游86 bp 處的T7 promoter（pEGFP_C2 中無(wú)對(duì)應(yīng)序列）作為上游引物，選用pEGFP_C2 MCS 下游61 bp 處的pEGFP_C3′（pcDNA3.1 中無(wú)對(duì)應(yīng)序列）作為下游引物。將兩種質(zhì)粒單獨(dú)作為模板時(shí)，都無(wú)法擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物；將兩種質(zhì)?；旌衔镒鳛槟０鍟r(shí)，很好地?cái)U(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物（圖1-A）。經(jīng)序列測(cè)定，該P(yáng)CR 產(chǎn)物中間為CDK4基因，兩端多余序列分別源自pcDNA3.1 與pEGFP_C2（圖1-B）。該DNA 片段長(zhǎng)1 057 bp，恰好為86 bp，909 bp（CDK4基因除終止密碼TGA 之外的長(zhǎng)度），61 bp 之和（圖1-C）?？梢?jiàn)平行模板法無(wú)法避免對(duì)原始野生型基因的擴(kuò)增。

2.2 兩種方案下目標(biāo)基因的擴(kuò)增

為驗(yàn)證旁側(cè)引物法的優(yōu)點(diǎn)，以在pEGFP_C2-CDK4基礎(chǔ)上制作其活性缺失突變體CDK4_D158N為例，采用常規(guī)末端引物與旁側(cè)引物進(jìn)行并行OEPCR 操作。常規(guī)末端引物分別為匹配CDK4基因兩端序列的CDK4_S（含EcoR I 位點(diǎn)與3 個(gè)保護(hù)堿基）與CDK4_A（含SalI 位點(diǎn)與2 個(gè)保護(hù)堿基）；旁側(cè)引物pEGFP_C5′位于EcoRI 位點(diǎn)上游75 bp，旁側(cè)引物pEGFP_C3′位于SalI 位點(diǎn)下游61 bp（圖2-A）。

圖1 平行模板法仍能擴(kuò)增原始基因

第一輪PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，得到各自所需的4 個(gè)片段（圖2-B）。將a+b 組合，c+d 組合進(jìn)行第二輪PCR，兩者皆得到相應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物（圖2-C）。且電泳結(jié)果顯示采用旁側(cè)引物時(shí)各PCR 產(chǎn)物都略大于常規(guī)末端引物下的產(chǎn)物，與預(yù)期相符。

圖2 OE-PCR 擴(kuò)增含點(diǎn)突變的目標(biāo)基因

2.3 突變體的克隆與鑒定

為檢測(cè)不用酶切時(shí)間對(duì)常規(guī)末端引物法的影響，對(duì)上述3 號(hào)產(chǎn)物（圖2-C）的雙酶切設(shè)置1 h 與4 h兩個(gè)時(shí)間組，以對(duì)比其效率差異。電泳結(jié)果顯示不同酶切作用時(shí)間下產(chǎn)物大小基本一致，看不出三者的明顯區(qū)別（圖3-A）。由于此時(shí)識(shí)別位點(diǎn)位于DNA末端，雙酶切只會(huì)使其縮短11 bp，故難以通過(guò)電泳結(jié)果判斷酶切作用是否充分。

為檢測(cè)旁側(cè)引物法下切除兩端多余序列后對(duì)終產(chǎn)物大小的影響，對(duì)7 號(hào)產(chǎn)物（圖2-C）用EcoRI與SalI 以不同的組合方式進(jìn)行酶切。考慮到此時(shí)識(shí)別位點(diǎn)位于DNA 中間，酶切效率高，故僅設(shè)置一個(gè)短時(shí)間組。電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4 種酶切組合下的產(chǎn)物大小不同，其中雙酶切產(chǎn)物最小，且條帶單一（圖3-B），說(shuō)明該產(chǎn)物已被充分酶切。

圖3 第二輪PCR 及酶切結(jié)果

將上述雙酶切產(chǎn)物連入載體后經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)以篩選目標(biāo)突變體。常規(guī)末端引物下酶切1 h 組只長(zhǎng)出3 個(gè)菌落，經(jīng)PCR 檢測(cè)，其中僅一個(gè)陽(yáng)性克?。▓D4-A），陽(yáng)性率僅33%。常規(guī)末端引物下酶切4 h 組長(zhǎng)出數(shù)十個(gè)菌落，任意挑取10 個(gè)菌落進(jìn)行PCR 檢測(cè)，得到7 個(gè)陽(yáng)性克?。▓D4-B），陽(yáng)性率達(dá)70%。旁側(cè)引物雙酶切1 h 組長(zhǎng)出數(shù)百個(gè)菌落，任意挑取10 個(gè)菌落進(jìn)行PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)全部都是陽(yáng)性克?。▓D4-C），陽(yáng)性率100%；對(duì)這10 個(gè)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果顯示全部都是pEGFP_C2-CDK4_D158N，即突變成功率為100%。

3 討論

圖4 不同方案下的平板篩選及菌落檢測(cè)結(jié)果

由于OE-PCR 定點(diǎn)突變程序繁瑣，很多科研工作者都試圖提出優(yōu)化方案，平行模板法即其中之一。然而，我們發(fā)現(xiàn)平行模板法并不能避免對(duì)原始野生型基因的擴(kuò)增。結(jié)合具體實(shí)例，并不難分析其原理。由T7 promoter 與pEGFP_C3′引物各自完全延伸的單鏈DNA 雖然在CDK4區(qū)域互補(bǔ)，但是沒(méi)有配對(duì)的3′-OH 末端，無(wú)法繼續(xù)延伸。而PCR 反應(yīng)中往往會(huì)有部分未完全延伸的產(chǎn)物，如果兩者恰好在各自的CDK4序列內(nèi)部中止延伸，那么這兩條單鏈DNA不只互補(bǔ)，且各有一個(gè)配對(duì)后的3′-OH 末端。因此可以互為模板繼續(xù)延伸，形成一條“雜交”DNA 雙鏈。其上游序列源自pcDNA3.1，中部為CDK4序列，下游序列源自pEGFP_C2。該“雜交”DNA 雙鏈可以作為后續(xù)循環(huán)的模板使目標(biāo)基因CDK4得以擴(kuò)增（圖5）。因此，試圖以平行模板法在一個(gè)小管內(nèi)完成OE-PCR 所有擴(kuò)增反應(yīng)的構(gòu)思是不成立的。

圖5 平行模板法擴(kuò)增目標(biāo)基因原理示意圖

Ⅱ型限制性內(nèi)切酶識(shí)別DNA 的特定序列并切開(kāi)雙鏈DNA，若酶切位點(diǎn)靠近DNA 末端，則酶切效率受到不同程度的影響［19-20］。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，往往在酶切位點(diǎn)外側(cè)添加1-3 個(gè)“保護(hù)堿基”以保證PCR 產(chǎn)物的酶切效率。盡管如此，其酶切效率有時(shí)也只能達(dá)到最大值的20%-50%（圖6-A）。低效酶切也成為基因克隆尤其是PCR 定點(diǎn)突變的重要制約因素。有兩種方法可提高此時(shí)的酶切效率，一是增加引物中“保護(hù)堿基”數(shù)目，但相應(yīng)地會(huì)增加實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，且非配對(duì)堿基數(shù)的增加還會(huì)降低PCR 成功率；二是增加酶切反應(yīng)的酶量或（和）延長(zhǎng)酶切作用時(shí)間，卻會(huì)增加內(nèi)切酶出現(xiàn)星號(hào)活性的風(fēng)險(xiǎn)。選用旁側(cè)引物可以很好地解決上述問(wèn)題，且可以避免諸多不利因素。旁側(cè)引物位于酶切位點(diǎn)外側(cè)50 bp-100 bp，此時(shí)對(duì)PCR 產(chǎn)物酶切近似于甚至優(yōu)于從質(zhì)粒中切取基因片段（質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)影響酶切效率），極大地提高酶切反應(yīng)的效率（圖6-B），由此縮短反應(yīng)時(shí)間，增加克隆形成數(shù)及陽(yáng)性率。

圖6 旁側(cè)引物法提高PCR 產(chǎn)物酶切效率原理示意圖

除此之外，旁側(cè)引物法還有以下兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，一是雙酶切產(chǎn)物與非酶切或單酶切產(chǎn)物大小有一定差異，可以通過(guò)電泳結(jié)果直接判斷酶切是否充分（圖3-B）。另外，當(dāng)突變位點(diǎn)靠近基因兩端時(shí)，采用常規(guī)末端引物會(huì)使第一輪PCR 產(chǎn)物之一偏小，不便于檢測(cè)及回收。此時(shí)采用旁側(cè)引物可以適當(dāng)增加DNA片段長(zhǎng)度，便于后續(xù)操作。旁側(cè)引物源于質(zhì)粒載體上的一段序列，只要插入該載體的基因，都可以之制作定點(diǎn)突變，不會(huì)過(guò)多增加實(shí)驗(yàn)成本。

平行模板法雖無(wú)法避免原始基因的擴(kuò)增，但是其擴(kuò)增效率明顯低于同一個(gè)質(zhì)粒上、下游引物對(duì)目標(biāo)基因的擴(kuò)增。因此，我們認(rèn)為仍可利用兩個(gè)平行質(zhì)粒分別作為第一輪PCR 上下游片段的擴(kuò)增模板，以減少定點(diǎn)突變過(guò)程中原始質(zhì)粒對(duì)第二輪PCR的“污染”。如果在第一輪PCR 時(shí)選用兩種不同的平行質(zhì)粒，除非兩者同時(shí)污染各自的PCR 產(chǎn)物，否則第二輪PCR 不會(huì)擴(kuò)增出原始基因，這樣就極大地減少了原始質(zhì)粒對(duì)后續(xù)操作的污染。

4 結(jié)論

本研究論證了平行模板法簡(jiǎn)化OE-PCR 定點(diǎn)突變流程的思路不能成立。我們認(rèn)為制約OE-PCR 定點(diǎn)突變效率的核心因素是靠近DNA 末端識(shí)別位點(diǎn)的低效限制性酶切。采用旁側(cè)引物法可提高PCR 產(chǎn)物的酶切效率，且便于通過(guò)電泳監(jiān)測(cè)酶切效果，既節(jié)省工作時(shí)間，又能大幅提高OE-PCR 定點(diǎn)突變的成功率。