王柳月 李慧美 馬夢(mèng)琪 梁明星 賀如陽(yáng) 陳華波
(湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院,襄陽(yáng) 441053)
定點(diǎn)突變是研究基因功能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的常用方法,目前主要使用PCR 介導(dǎo)的突變引入技術(shù)。PCR 即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是一種在體外迅速擴(kuò)增特定目標(biāo)DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)[1-2]。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的重疊延伸PCR(Overlap extension PCR,OE-PCR)是基因定點(diǎn)突變的主要方法[3-5]。整個(gè)OE-PCR 需要4 條引物,兩輪共3 次PCR 反應(yīng),其繁瑣的流程一直為科研工作者所詬?。?-8]。近年來(lái)陸續(xù)發(fā)展出新的定點(diǎn)突變解決方案,主要有滾環(huán)擴(kuò)增法與大引物PCR 法[9],據(jù)稱能簡(jiǎn)化流程,提高突變效率。也有研究者認(rèn)為這兩種方法各有弊端,如滾環(huán)擴(kuò)增法容易引入新的非預(yù)期突變[10],而大引物PCR 法始終無(wú)法徹底避免對(duì)原始基因的擴(kuò)增[11]。因此,大多數(shù)科研工作者仍傾向于使用OE-PCR 法制作定點(diǎn)突變,并不斷提出優(yōu)化方案以期提升工作效率。如有人提出平行模板法可以避免原始基因的擴(kuò)增,于是可在同一個(gè)小管內(nèi)完成對(duì)基因突變體的擴(kuò)增[12]。
結(jié)合實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)OE-PCR 定點(diǎn)突變時(shí)效率不穩(wěn)定,表現(xiàn)為轉(zhuǎn)化之后的克隆形成數(shù)較少,克隆陽(yáng)性率偏低。另一個(gè)較為普遍的現(xiàn)象是當(dāng)把基因從一個(gè)載體中酶切出來(lái)直接連入另一個(gè)載體時(shí),轉(zhuǎn)化形成的克隆數(shù)較多,檢測(cè)陽(yáng)性率較高(幾乎100%)。而克隆一個(gè)新基因或制作一個(gè)定點(diǎn)突變時(shí),轉(zhuǎn)化形成的克隆數(shù)較少,檢測(cè)陽(yáng)性率也往往不高。適當(dāng)增加酶濃度,或延長(zhǎng)酶切時(shí)間有助于增加克隆形成數(shù)和陽(yáng)性率,但始終無(wú)法達(dá)到前者的效果。兩者的主要區(qū)別在于前者酶切PCR 產(chǎn)物時(shí)切點(diǎn)往往位于DNA 末端,而后者酶切質(zhì)粒時(shí)切點(diǎn)位于DNA 中間。大多數(shù)限制性內(nèi)切酶都不能作用于DNA 頂端序列,因此在設(shè)計(jì)引物時(shí)會(huì)在酶切位點(diǎn)外側(cè)增加1-3 個(gè)“保護(hù)堿基”,盡管如此其酶切效率往往只能達(dá)到最大值的20%-50%.據(jù)此推測(cè)靠近PCR 產(chǎn)物末端的低效限制性酶切是制約基因克隆和定點(diǎn)突變效率的主要原因。據(jù)此,我們提出旁側(cè)引物法以期改善定點(diǎn)突變效率。即將常規(guī)OE-PCR 上、下游引物匹配位點(diǎn)由基因兩端外延50-100 bp,適當(dāng)增加第二輪PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度,使目標(biāo)基因兩側(cè)的酶切位點(diǎn)遠(yuǎn)離DNA 末端,從而提高隨后的酶切效率。
周期蛋白依賴性激酶4(Cyclin-dependent kinase 4,CDK4)是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)基因[13-14],它與cyclin D1以復(fù)合物的形式共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1/S 轉(zhuǎn)換[15-16]。CDK4_D158N 是其重要的激酶活性缺失突變體,常用于CDK4功能研究[17]。以制作CDK4_D158N 為例,采用常規(guī)引物與旁側(cè)引物法并行OEPCR 操作,發(fā)現(xiàn)旁側(cè)引物法極大地提高了基因定點(diǎn)突變的克隆形成數(shù)與突變成功率。
1.1.1 菌種與質(zhì)粒 感受態(tài)大腸桿菌Trans5α Chemically Competent Cell(CD201-01)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒pEGFP_C2(Catalog#6083-1,Clontech),pcDNA3.1(Catalog no. V800-20,Invitrogen)及CDK4基因相關(guān)質(zhì)粒由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張傳茂教授饋贈(zèng)。
1.1.2 試 劑 2×PCR Reagent(KT207) 購(gòu) 自 天根生化科技(北京)有限公司;PyrobestTMDNA Polymerase(R005A),DNA Ligation Kit Ver.2.1(6002)購(gòu)自Takara 寶生物工程(大連)有限公司;內(nèi)切酶EcoR I(R0101V)、SalI(R0138V)購(gòu)自NEB 紐英倫生物技術(shù)北京有限公司;DNA 快速回收/純化試劑盒(NEP013-2)購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒(D0003)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)。
1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 旁側(cè)引物序列參考Invitrogen 中國(guó)測(cè)序通用引物序列(http://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/china/common-vector-primer-list.pdf),其他引物采用Primer Premier 5. 0 軟件設(shè)計(jì),相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成,經(jīng)PAGE 純化。
表1 引物信息表
1.2.2 PCR 擴(kuò)增目標(biāo)基因及陽(yáng)性菌落檢測(cè) 擴(kuò)增目標(biāo)基因采用高保真PyrobestTMDNA Polymerase,第一輪PCR 方案:2 μL 10×buffer,1.2 μL dNTP,0.2 μL primer 1,0.2 μL primer 2,0.2 μL 酶,0.1 μL(10 ng)質(zhì)粒,補(bǔ)水至20 μL;第二輪PCR 方案:2 μL 10×buffer,2 μL dNTP,0.2 μL primer 1,0.2 μL primer 2,0.2 μL 酶,0.5 μL 上游片段回收物,0.5 μL下游片段回收物,補(bǔ)水至20 μL;運(yùn)行程序皆為:94℃ 5 min;94℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 1 min,30 循環(huán);72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收至20 μL ddH2O 中。用PCR 法檢測(cè)陽(yáng)性菌落時(shí)選用快速2×PCR Reagent,方案:5 μL 2×Taq,0.1 μL primer 1,0.1 μL primer 2,0.8 μL 細(xì)菌培養(yǎng)物,補(bǔ)水至10 μL;擴(kuò)增條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 45 s,30 循環(huán);72℃ 5 min。
1.2.3 基因克隆與序列分析 取5 μL 含點(diǎn)突變的目的基因回收物,加2 μL 10×buffer,0.5 μLEcoRI,0.5 μL,SalI,補(bǔ)水至20 μL,37℃孵育一定時(shí)間;取pEGFP_C2 質(zhì)粒1 μg,采取上述同樣方式酶切1 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后回收至20 μL ddH2O 中。用DNA Ligation Kit Ver.2.1 連接:載體0.5 μL,DNA片段4.5 μL,solution I 5 μL 混合,16℃孵育30 min。連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌,用卡那霉素固體培養(yǎng)基篩選,結(jié)合PCR 檢測(cè)陽(yáng)性菌落。對(duì)相應(yīng)PCR 產(chǎn)物回收或陽(yáng)性菌落小量提取質(zhì)粒后進(jìn)行序列測(cè)定,序列測(cè)定采用ABI3730 系列測(cè)序儀,由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。
平行模板法即選用兩個(gè)含同一目標(biāo)基因的不同質(zhì)粒作為模板,在這兩個(gè)質(zhì)粒上分別選一段序列作為引物[18],支持者認(rèn)為“當(dāng)兩種模板和兩條外側(cè)引物同時(shí)存在于一個(gè)反應(yīng)管時(shí),可以完全避免對(duì)野生型目的基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增[12],只有在突變引物存在的情況下才能擴(kuò)增出產(chǎn)物,因此目標(biāo)產(chǎn)物一定含有預(yù)期定點(diǎn)突變。為檢測(cè)上述理論,選用pEGFP_C2-CDK4與pcDNA3.1-CDK4兩種質(zhì)粒作為平行模板,選用pcDNA3.1 多克隆位點(diǎn)(Multiple cloning site,MCS)上游86 bp 處的T7 promoter(pEGFP_C2 中無(wú)對(duì)應(yīng)序列)作為上游引物,選用pEGFP_C2 MCS 下游61 bp 處的pEGFP_C3′(pcDNA3.1 中無(wú)對(duì)應(yīng)序列)作為下游引物。將兩種質(zhì)粒單獨(dú)作為模板時(shí),都無(wú)法擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物;將兩種質(zhì)?;旌衔镒鳛槟0鍟r(shí),很好地?cái)U(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物(圖1-A)。經(jīng)序列測(cè)定,該P(yáng)CR 產(chǎn)物中間為CDK4基因,兩端多余序列分別源自pcDNA3.1 與pEGFP_C2(圖1-B)。該DNA 片段長(zhǎng)1 057 bp,恰好為86 bp,909 bp(CDK4基因除終止密碼TGA 之外的長(zhǎng)度),61 bp 之和(圖1-C)??梢?jiàn)平行模板法無(wú)法避免對(duì)原始野生型基因的擴(kuò)增。
為驗(yàn)證旁側(cè)引物法的優(yōu)點(diǎn),以在pEGFP_C2-CDK4基礎(chǔ)上制作其活性缺失突變體CDK4_D158N為例,采用常規(guī)末端引物與旁側(cè)引物進(jìn)行并行OEPCR 操作。常規(guī)末端引物分別為匹配CDK4基因兩端序列的CDK4_S(含EcoR I 位點(diǎn)與3 個(gè)保護(hù)堿基)與CDK4_A(含SalI 位點(diǎn)與2 個(gè)保護(hù)堿基);旁側(cè)引物pEGFP_C5′位于EcoRI 位點(diǎn)上游75 bp,旁側(cè)引物pEGFP_C3′位于SalI 位點(diǎn)下游61 bp(圖2-A)。
圖1 平行模板法仍能擴(kuò)增原始基因
第一輪PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè),得到各自所需的4 個(gè)片段(圖2-B)。將a+b 組合,c+d 組合進(jìn)行第二輪PCR,兩者皆得到相應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物(圖2-C)。且電泳結(jié)果顯示采用旁側(cè)引物時(shí)各PCR 產(chǎn)物都略大于常規(guī)末端引物下的產(chǎn)物,與預(yù)期相符。
圖2 OE-PCR 擴(kuò)增含點(diǎn)突變的目標(biāo)基因
為檢測(cè)不用酶切時(shí)間對(duì)常規(guī)末端引物法的影響,對(duì)上述3 號(hào)產(chǎn)物(圖2-C)的雙酶切設(shè)置1 h 與4 h兩個(gè)時(shí)間組,以對(duì)比其效率差異。電泳結(jié)果顯示不同酶切作用時(shí)間下產(chǎn)物大小基本一致,看不出三者的明顯區(qū)別(圖3-A)。由于此時(shí)識(shí)別位點(diǎn)位于DNA末端,雙酶切只會(huì)使其縮短11 bp,故難以通過(guò)電泳結(jié)果判斷酶切作用是否充分。
為檢測(cè)旁側(cè)引物法下切除兩端多余序列后對(duì)終產(chǎn)物大小的影響,對(duì)7 號(hào)產(chǎn)物(圖2-C)用EcoRI與SalI 以不同的組合方式進(jìn)行酶切。考慮到此時(shí)識(shí)別位點(diǎn)位于DNA 中間,酶切效率高,故僅設(shè)置一個(gè)短時(shí)間組。電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4 種酶切組合下的產(chǎn)物大小不同,其中雙酶切產(chǎn)物最小,且條帶單一(圖3-B),說(shuō)明該產(chǎn)物已被充分酶切。
圖3 第二輪PCR 及酶切結(jié)果
將上述雙酶切產(chǎn)物連入載體后經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)以篩選目標(biāo)突變體。常規(guī)末端引物下酶切1 h 組只長(zhǎng)出3 個(gè)菌落,經(jīng)PCR 檢測(cè),其中僅一個(gè)陽(yáng)性克?。▓D4-A),陽(yáng)性率僅33%。常規(guī)末端引物下酶切4 h 組長(zhǎng)出數(shù)十個(gè)菌落,任意挑取10 個(gè)菌落進(jìn)行PCR 檢測(cè),得到7 個(gè)陽(yáng)性克?。▓D4-B),陽(yáng)性率達(dá)70%。旁側(cè)引物雙酶切1 h 組長(zhǎng)出數(shù)百個(gè)菌落,任意挑取10 個(gè)菌落進(jìn)行PCR 檢測(cè),發(fā)現(xiàn)全部都是陽(yáng)性克?。▓D4-C),陽(yáng)性率100%;對(duì)這10 個(gè)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定,結(jié)果顯示全部都是pEGFP_C2-CDK4_D158N,即突變成功率為100%。
圖4 不同方案下的平板篩選及菌落檢測(cè)結(jié)果
由于OE-PCR 定點(diǎn)突變程序繁瑣,很多科研工作者都試圖提出優(yōu)化方案,平行模板法即其中之一。然而,我們發(fā)現(xiàn)平行模板法并不能避免對(duì)原始野生型基因的擴(kuò)增。結(jié)合具體實(shí)例,并不難分析其原理。由T7 promoter 與pEGFP_C3′引物各自完全延伸的單鏈DNA 雖然在CDK4區(qū)域互補(bǔ),但是沒(méi)有配對(duì)的3′-OH 末端,無(wú)法繼續(xù)延伸。而PCR 反應(yīng)中往往會(huì)有部分未完全延伸的產(chǎn)物,如果兩者恰好在各自的CDK4序列內(nèi)部中止延伸,那么這兩條單鏈DNA不只互補(bǔ),且各有一個(gè)配對(duì)后的3′-OH 末端。因此可以互為模板繼續(xù)延伸,形成一條“雜交”DNA 雙鏈。其上游序列源自pcDNA3.1,中部為CDK4序列,下游序列源自pEGFP_C2。該“雜交”DNA 雙鏈可以作為后續(xù)循環(huán)的模板使目標(biāo)基因CDK4得以擴(kuò)增(圖5)。因此,試圖以平行模板法在一個(gè)小管內(nèi)完成OE-PCR 所有擴(kuò)增反應(yīng)的構(gòu)思是不成立的。
圖5 平行模板法擴(kuò)增目標(biāo)基因原理示意圖
Ⅱ型限制性內(nèi)切酶識(shí)別DNA 的特定序列并切開(kāi)雙鏈DNA,若酶切位點(diǎn)靠近DNA 末端,則酶切效率受到不同程度的影響[19-20]。在設(shè)計(jì)引物時(shí),往往在酶切位點(diǎn)外側(cè)添加1-3 個(gè)“保護(hù)堿基”以保證PCR 產(chǎn)物的酶切效率。盡管如此,其酶切效率有時(shí)也只能達(dá)到最大值的20%-50%(圖6-A)。低效酶切也成為基因克隆尤其是PCR 定點(diǎn)突變的重要制約因素。有兩種方法可提高此時(shí)的酶切效率,一是增加引物中“保護(hù)堿基”數(shù)目,但相應(yīng)地會(huì)增加實(shí)驗(yàn)費(fèi)用,且非配對(duì)堿基數(shù)的增加還會(huì)降低PCR 成功率;二是增加酶切反應(yīng)的酶量或(和)延長(zhǎng)酶切作用時(shí)間,卻會(huì)增加內(nèi)切酶出現(xiàn)星號(hào)活性的風(fēng)險(xiǎn)。選用旁側(cè)引物可以很好地解決上述問(wèn)題,且可以避免諸多不利因素。旁側(cè)引物位于酶切位點(diǎn)外側(cè)50 bp-100 bp,此時(shí)對(duì)PCR 產(chǎn)物酶切近似于甚至優(yōu)于從質(zhì)粒中切取基因片段(質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)影響酶切效率),極大地提高酶切反應(yīng)的效率(圖6-B),由此縮短反應(yīng)時(shí)間,增加克隆形成數(shù)及陽(yáng)性率。
圖6 旁側(cè)引物法提高PCR 產(chǎn)物酶切效率原理示意圖
除此之外,旁側(cè)引物法還有以下兩個(gè)優(yōu)點(diǎn),一是雙酶切產(chǎn)物與非酶切或單酶切產(chǎn)物大小有一定差異,可以通過(guò)電泳結(jié)果直接判斷酶切是否充分(圖3-B)。另外,當(dāng)突變位點(diǎn)靠近基因兩端時(shí),采用常規(guī)末端引物會(huì)使第一輪PCR 產(chǎn)物之一偏小,不便于檢測(cè)及回收。此時(shí)采用旁側(cè)引物可以適當(dāng)增加DNA片段長(zhǎng)度,便于后續(xù)操作。旁側(cè)引物源于質(zhì)粒載體上的一段序列,只要插入該載體的基因,都可以之制作定點(diǎn)突變,不會(huì)過(guò)多增加實(shí)驗(yàn)成本。
平行模板法雖無(wú)法避免原始基因的擴(kuò)增,但是其擴(kuò)增效率明顯低于同一個(gè)質(zhì)粒上、下游引物對(duì)目標(biāo)基因的擴(kuò)增。因此,我們認(rèn)為仍可利用兩個(gè)平行質(zhì)粒分別作為第一輪PCR 上下游片段的擴(kuò)增模板,以減少定點(diǎn)突變過(guò)程中原始質(zhì)粒對(duì)第二輪PCR的“污染”。如果在第一輪PCR 時(shí)選用兩種不同的平行質(zhì)粒,除非兩者同時(shí)污染各自的PCR 產(chǎn)物,否則第二輪PCR 不會(huì)擴(kuò)增出原始基因,這樣就極大地減少了原始質(zhì)粒對(duì)后續(xù)操作的污染。
本研究論證了平行模板法簡(jiǎn)化OE-PCR 定點(diǎn)突變流程的思路不能成立。我們認(rèn)為制約OE-PCR 定點(diǎn)突變效率的核心因素是靠近DNA 末端識(shí)別位點(diǎn)的低效限制性酶切。采用旁側(cè)引物法可提高PCR 產(chǎn)物的酶切效率,且便于通過(guò)電泳監(jiān)測(cè)酶切效果,既節(jié)省工作時(shí)間,又能大幅提高OE-PCR 定點(diǎn)突變的成功率。