李志 周秋香 黎秋玲 劉孟熒 周智友 李漢廣

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院 江西農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室/江西省菌物資源保護與利用重點實驗室，南昌330045；2. 江西農(nóng)業(yè)大學醫(yī)院，南昌 330045）

隨著世界人口的快速增長以及工業(yè)化水平的不斷提高，傳統(tǒng)化石能源的逐年消耗對人類社會的發(fā)展構(gòu)成了嚴重威脅［1］；而且傳統(tǒng)化石能源是一種不可再生資源，其已探明的儲量有限，因此世界各國對于可持續(xù)綠色能源的需求也日益增加［2-4］。生物柴油因其可持續(xù)再生而備受關(guān)注［5］。生物柴油是一種由動物脂肪和植物油轉(zhuǎn)制加工而成的綠色燃料。微藻因其具有光合效率高、生長速度快以及總脂含量較高等優(yōu)點而被公認為是生物柴油制造原料的一種極佳選擇［6］。優(yōu)良的藻種是提高微藻生物柴油生產(chǎn)性能的重要保障［7］，因此建立一種簡便、高效、快速的總脂含量測定方法對高總脂含量藻種的高通量篩選以及微藻高密度培養(yǎng)就顯得尤為重要［8］。目前可查閱的文獻中有很多關(guān)于微藻總脂含量的測定［8-9］，但在已開展的測定方法中傳統(tǒng)的方法諸如重量法、有機溶劑提取法等，雖然能較為準確地測量出油脂含量，但均需先將細胞中的油脂提取出來，此過程費時費力，不利于實際生產(chǎn)。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，許多更為高效的方法正得到廣泛的關(guān)注，這些方法不需要對油脂進行提取，測量簡便，而且可以進行快速、高效的測定。本文將從化學和物理方法兩方面簡要概述近年來廣泛開展的微藻油脂測定方法的基本原理，并對其各自的優(yōu)缺點進行比較，以期為廣大研究者提供一定價值的參考。

1 化學測定方法

1.1 尼羅紅熒光光譜法

尼羅紅（9-diethylamino-5H-benzo［α］phenoxazine-5-one）是一種脂溶性的熒光染料，它經(jīng)常用于測定不同微生物的脂類含量。尼羅紅極易溶于有機溶劑且在有機溶劑中具有很強的熒光特性，它可以進入微藻細胞內(nèi)與脂類（尤其是中性脂）結(jié)合，通過熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測到它在特定波長激發(fā)下發(fā)出的熒光檢測信號［10］，并以此來計算細胞內(nèi)中性脂含量。其熒光強度與細胞內(nèi)的中性脂含量呈線性關(guān)系［11］，因此可以構(gòu)建油脂含量和熒光強度的回歸方程，由此來測定微藻細胞的油脂含量。曹素娟等［12］為探究快速高通量測定三角褐指藻油脂含量的方法，通過對三角褐指藻的油脂含量（x）與熒光強度（y）進行回歸分析發(fā)現(xiàn)，兩者相關(guān)性較好（R2= 0.925），實驗結(jié)果表明可以利用尼羅紅熒光光譜法測定三角褐指藻的油脂含量，且與傳統(tǒng)的有機溶劑提取法相比，尼羅紅熒光光譜法具有無需對細胞進行破壞、所需樣品量少、測定速率快、靈敏度高等優(yōu)點［13］。叢峰等［14］對幾種小球藻油脂含量檢測方法進行了比較，結(jié)果顯示，尼羅紅熒光光譜法對濕藻粉所測得的油脂含量為12.5 ± 0.921%，其結(jié)果與其他測定方法所得結(jié)果基本一致。

然而，尼羅紅熒光光譜法在實際實驗過程中也存在一些不足之處，比如，此法對細胞壁較厚的微藻測定效果較差，測定結(jié)果易受尼羅紅或藻液濃度大小的影響甚至染色時間和溫度也會對測定結(jié)果造成干擾。所以許多研究者在使用此法進行微藻油脂含量測定之前，大多都會對其染色條件進行優(yōu)化，以此來增加細胞壁或細胞膜的通透性從而提高染色效率。Chen 等［15］在研究過程中發(fā)現(xiàn)，通過對染色條件進行優(yōu)化來測定微藻油脂含量，與優(yōu)化前的方法比較，優(yōu)化后的測定結(jié)果與重量法測定結(jié)果相關(guān)性很高（R2=0.998）。其優(yōu)化后的條件為：20%DMSO（V/V），尼羅紅染料濃度為0.5 μg/mL，染色10 min，激發(fā)波長為530 nm，發(fā)射波長為575 nm。Storms 等［16］為測定小球藻中中性油脂的含量，對染色條件進行優(yōu)化，首先利用乙醇作為溶劑，并且在測定熒光強度的過程中借助96 孔板增加樣本的容量，結(jié)果顯示，所測的熒光強度和小球藻油脂含量具有很強的相關(guān)性。雖然優(yōu)化后尼羅紅熒光光譜法能夠有一個較好的測定結(jié)果，但由于尼羅紅自身的光譜特性對環(huán)境極性較為敏感，在一定程度上限制了其使用。

1.2 BODIPY 505/515熒光染色法

氟硼熒又稱氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川類化合物，（Boron-dipyrromethene，BODIPY 505/515），也 是一種脂溶性的熒光染料，能夠?qū)罴毎麅?nèi)油滴進行染色，在激發(fā)光照射下會產(chǎn)生綠色熒光，通過對其熒光信號進行檢測進而對細胞油脂含量進行測定。BODIPY 505/515 相較于尼羅紅而言，其滲透性與穩(wěn)定性更好，即使在光照條件下也不易光解，而且其放射光譜較窄，有利于共焦成像，更利于實驗觀察［17］。Koreivien?［18］對 尼 羅 紅和BODIPY 505/515兩者在微藻油脂含量測定方面的優(yōu)缺點進行了比較，表明BODIPY 505/515 對微藻進行染色后，其熒光更穩(wěn)定，染色速率更快，染色受細胞壁的厚度影響更小，而且對于中性脂肪酸的選擇性也強于尼羅紅。Rumin等［19］討論了尼羅紅和BODIPY 505/515 兩者在諸如光譜特性、染料濃度、細胞濃度、染色溫度和培養(yǎng)溫度等方面的區(qū)別發(fā)現(xiàn)，無論是尼羅紅或BODIPY 505/515 對油脂的測定相較于傳統(tǒng)的重量法，均具有十分顯著的優(yōu)點。但在實際應(yīng)用中，它們的測定結(jié)果依舊會受到諸如染色時長、溶劑種類等因素影響，因此如何減少這些因素的影響，還有待進一步的研究。

1.3 銅試劑法

最初銅試劑法是用來測定少量銅離子的方法，此法中所用的銅試劑為二乙基二硫代氨基甲酸鈉［Sodium diethyldithiocarbamate，（C2H5）2NCSSNa·3H2O］。銅試劑作用原理是因為它可與銅離子在堿性溶液中發(fā)生顏色反應(yīng)，生成黃棕色絡(luò)合物，通過氯仿對此絡(luò)合物進行萃取，然后在440 nm 波長處測定其OD 值，從而獲得銅離子含量［20］。Wawrik 等［21］在此原理基礎(chǔ)上，并結(jié)合氯仿測定脂肪酸的技術(shù)，建立了一種利用銅試劑來測定微藻總脂含量的方法；該方法的具體測定過程如下：首先將微藻油脂皂化，隨后將銅試劑加入到皂化后的溶液中，待成鹽后，再用含二乙基二硫代氨基甲酸鈉的氯仿進行萃取，皂化物在遇到二乙基二硫代氨基甲酸鈉后會發(fā)生顏色反應(yīng)，變成黃棕色，其在440 nm 波長處有最大吸收，通過測量440 nm 波長處的OD 值，從而獲得微藻的油脂含量。作者通過對小球藻和三角褐指藻細胞內(nèi)的油脂進行測定，計算得出其產(chǎn)率分別為12.0 ± 0.56%、9.40 ± 1.77%。與傳統(tǒng)油脂測定方法相比，銅試劑法所需樣品量少，且具有耗時短（可以在2 h 內(nèi)完成大約30 個樣品的測定）、靈敏度很高、成本低（每次測定成本不足5 美元）等優(yōu)點，因此，此種方法不失為一種理想的微藻油脂測定方法。但在研究過程中，作者通過對各個脂肪酸的摩爾消光系數(shù)進行對比發(fā)現(xiàn)，銅試劑法會因為不飽和脂肪酸或者相關(guān)化學修飾（酮基和氨基酸結(jié)構(gòu)）的影響而導致檢測結(jié)果偏低［21］。同時，值得注意的是，目前關(guān)于此法測定其他藻種油脂含量的報道相對也較少，因此此種方法測定不同藻種油脂含量的有效性還需大量的實驗進行進一步論證。

1.4 蘇丹黑B染色法

蘇丹黑B 是一種脂溶性的染色劑，它不僅價格低廉而且毒性非常微弱，能夠與脂質(zhì)特別是中性脂相結(jié)合而形成黑色或黑藍色絡(luò)合物，在645 nm 波長處下有最大吸收峰，此吸收值的大小與細胞總脂含量呈顯著線性相關(guān)，因此通過測定細胞經(jīng)染色后的吸光值A(chǔ)645，再將其代入相應(yīng)的線性方程中，即可計算出細胞內(nèi)油脂含量，因此蘇丹黑B 被廣泛地用于真菌、酵母、動物細胞內(nèi)的油脂含量的檢測［22-23］。Ren 等［24］通過蘇丹黑B 染色法對不同生理狀態(tài)的小球藻細胞的油脂含量進行測定，結(jié)果顯示，經(jīng)蘇丹黑B 染色后所得的吸光度值與油脂含量呈極顯著相關(guān)（P＜ 0.001），表明蘇丹黑B 染色法用于微藻油脂含量測定的可行性。金雪潔等［25］以兩株淡水小球藻為研究對象，對蘇丹黑B 染色法進行優(yōu)化來提高染色效果，結(jié)果表明，微藻細胞的油脂含量與吸光值存在良好的線性關(guān)系，測得的油脂含量與傳統(tǒng)方法測得的結(jié)果非常接近，表明蘇丹黑B 染色法對微藻油脂含量測定切實可行。彭悅等［26］采用此法對球等金鞭藻和小新菱形藻的油脂含量以及油脂積累過程油脂含量的快速檢測進行了探究，結(jié)果表明，蘇丹黑B 染色法不僅對微藻油脂的含量檢測具有較高的準確度，而且能快速頻繁地對油脂含量進行測定。雖然蘇丹黑B 染色法在微藻油脂含量測定中有廣泛的應(yīng)用，但蘇丹黑B 染色法本身也存在一定的局限性，即當樣品濃度過高或樣品不夠均勻時，蘇丹黑B 染色法的檢測效果就不夠理想，同時蘇丹黑B 染色后脂滴呈現(xiàn)藍黑色觀察起來會有誤差，并且蘇丹黑B 染色法只能測定油脂的相對含量［27］。因此，如何減少自身熒光的干擾將是促進此法發(fā)展的關(guān)鍵。

2 物理測定方法

2.1 傅里葉變換紅外光譜法

傅里葉變換紅外光譜法（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）是微藻油脂含量檢測的較理想的方法之一。FTIR 法的基本原理是：物質(zhì)會在紅外光譜的特定區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生伸縮振動，形成特定的吸收峰，而后在干涉儀的作用下形成的干涉光會與微藻油脂作用形成干涉信號，再對這些信號進行傅里葉變換，形成相關(guān)的光譜圖，通過對光譜圖中相關(guān)吸收峰的位置和形狀等信息進行分析，從而對物質(zhì)含量進行測定［28］。FTIR 法具有是高效、快速、所需樣品量少、操作簡便等特點［28］。Giordano 等［29］通過FTIR 法測定在氮濃度變化過程中牟氏角毛藻細胞內(nèi)總脂、蛋白質(zhì)和碳水化合物等的變化，結(jié)果表明FTIR 法不僅對于總脂含量的測定很有效果，而且對于測定單細胞生物成分也十分可靠。Jyoti 等［30］通過此法對不同地區(qū)的藻種細胞內(nèi)的油脂、蛋白質(zhì)以及碳水化合物進行測定，也得出了與Giordano 等一致的結(jié)論。Dean 等［31］利用此法對兩種淡水藻進行細胞內(nèi)脂類和碳水化合物的含量進行測定，得出的結(jié)果表明，F(xiàn)TIR 法不僅是一種高效快速測定油脂的方法，也是測量其他組分的高效方法。陳小妹等［32］通過FTIR 法對在不同氮濃度條件下的產(chǎn)油微藻細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、總脂和碳水化合物等相關(guān)生化組分進行測定，結(jié)果顯示最終總脂含量在低氮組達到最高（為66.1%），蛋白質(zhì)和碳水化合物在高氮組達到最高，分別為13.05 g/L 和23.36 g/L，與傳統(tǒng)方法測得的結(jié)果都呈現(xiàn)了很好的相關(guān)性上述實驗 表 明FTIR 法不僅是一種有效測定微藻細胞內(nèi)總脂含量的方法，還是一種測定細胞內(nèi)生化組分的可靠的方法。但Jyoti 等［30］研究顯示重量法作為一種絕對定量的油脂測量方法，其測定結(jié)果可以做到絕對定量且較FTIR 法更高，更準確，也從側(cè)面說明FTIR 法存在著一定的不足。從上述各項研究表明盡管FTIR 法是一種十分高效、無損的油脂測定方法，但因其測定的是微藻中油脂的相對含量，同時測定值也相對偏小，且測定設(shè)備價格較為昂貴等，從而限制了此法在微藻油含量測定中的應(yīng)用。

2.2 時域核磁共振法

時域核磁共振技術(shù)（Time-Domain nuclear magnetic resonance，TD-NMR）作為一種方便的物質(zhì)測定方法，其在微藻生物柴油領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用［33］。TD-NMR 是通過脈沖將一段高能量的射頻信號施加到樣品上，在靜磁場中樣品的氫原子核發(fā)生能級躍遷，在一定時間內(nèi)氫原子核從激發(fā)態(tài)恢復到平衡狀態(tài)（此過程稱為弛豫過程，它所需時間稱為弛豫時間）并同時產(chǎn)生衰減信號，根據(jù)衰減信號的強度和信號衰減速率，可以區(qū)分脂質(zhì)和其他氫核信號，并且以此測量脂質(zhì)含量，更通俗而言就是根據(jù)氫質(zhì)子在不同物質(zhì)中弛豫時間不同來測量油脂含量［34］。Gao 等［35］分別用TD-NMR 和尼羅紅熒光光譜法對原殼小球藻的總脂含量進行測定，結(jié)果表明，這兩種方法均切實可行，且與常用的重量法相比更為簡單，而且核磁共振法實驗結(jié)果與重量法實驗結(jié)果擬合的R2為0.997，因此作者認為TD-NMR法是一種準確、快速測量微藻油脂含量的方法。劉婷婷等［36］利用TD-NMR 法，建立了一種直接測定微藻干藻粉和培養(yǎng)基中小球藻油脂含量的方法，其信號強度和油脂含量存在線性關(guān)系，無論是干藻粉還是藻液，它們油脂含量與信號強度擬合后的R2均高于0.99，具體分別為0.997 和0.998。上述研究結(jié)果表明該方法對于微藻油脂含量檢測的準確性和可行性，但因TD-NMR 技術(shù)靈敏度的原因，此法仍需要較大的生物量才能準確地檢測出油脂含量，不過相較于傳統(tǒng)的油脂測定方法而言，TD-NMR 法具有準確、快速、無損、重現(xiàn)性高、無需提取油脂等優(yōu)點。因此，其在油脂測量方面將具有美好的應(yīng)用前景。

2.3 可見/近紅外光譜法

可見/近紅外（Vis/Near infrared spectrum instrument，NIRS）光譜技術(shù)是利用分子振動從基態(tài)向高能級躍遷產(chǎn)生的譜線進行檢測的技術(shù)。可見/近紅外光譜技術(shù)可以檢測特定波長處的光譜信息，根據(jù)光譜的特征，并結(jié)合化學計量學方法就可以對樣品進行定量或定性的分析［37］。魏萱等［38］采用NIRS 技術(shù)獲取了不同光源培養(yǎng)條件下的小球藻生長過程中油脂動態(tài)變化和油脂含量分布的光譜信息，通過與干重法獲取的油脂含量建立多元線性回歸預測模型，預測的相關(guān)系數(shù)R2達到0.940，表明NIRS 技術(shù)可以實現(xiàn)對微藻內(nèi)油脂含量的快速無損檢測。Brown 等［39］借助NIRS 技術(shù)對產(chǎn)油微藻的油脂含量以及生物量進行檢測，通過對這些物質(zhì)的信息進行整合，開發(fā)了用于檢測總生物量和油脂含量的模型，對于一些藻種油脂含量的檢測，模型都給出了很好的檢測效果（R2≥ 0.960），而且Brown 在研究中還發(fā)現(xiàn)，此法可以進行快速的油脂檢測，每天檢測的樣品可多達200 余份，說明此法作為微藻油脂檢測的高效性。但由于此法在微藻油脂測定方面的應(yīng)用還處在發(fā)展階段，在檢測過程中，需要大量的樣品及工作量來建立數(shù)據(jù)庫，因此要完善此法的實際使用，還需要微藻研究者之間相互合作、數(shù)據(jù)共享，建立一個更為全面的圖譜數(shù)據(jù)庫，以完善此法的實際應(yīng)用。

3 總結(jié)與展望

由于微藻生物柴油具有可持續(xù)、高產(chǎn)油率、低能耗等諸多優(yōu)勢，微藻生物質(zhì)柴油已經(jīng)成為生物能源研究中的熱點方向之一。建立一種高效、準確的微藻油脂測定方法對于快速篩選出高油脂含量藻株，以及對微藻培養(yǎng)過程進行優(yōu)化以提高其產(chǎn)油能力是實現(xiàn)微藻生物質(zhì)柴油能源化利用的關(guān)鍵。高效快速的油脂含量測定方法可以有效解決傳統(tǒng)微藻油脂含量測定方法過程中效率低、耗時長、步驟繁雜、污染大等問題。本文以目前微藻篩選及培養(yǎng)過程中幾種常見的高效快速的測定方法為例，介紹了其測定微藻油脂含量的基本原理以及具體的實際應(yīng)用，同時對各種方法的優(yōu)缺點、準確性、適用性等進行了比較。

從表1 可知，無論是化學方法或是物理方法都各有優(yōu)劣，化學法多要借助熒光染料或?qū)Ｓ玫幕瘜W試劑，物理法則需要借助相應(yīng)的儀器；化學法因無需購買昂貴的儀器測定所需總體成本相對物理法更低，但物理法卻可以借助儀器實現(xiàn)更高效更快速的實驗；而與傳統(tǒng)的油脂測定方法相比，這些測定方法具有步驟簡便、結(jié)果準確、測定快速等優(yōu)勢，但在實際應(yīng)用中，還存在一些問題。例如，尼羅紅等熒光染料在水溶液中的穩(wěn)定性、紅外光譜檢測結(jié)果的可重復性問題，上述問題也是未來有關(guān)優(yōu)化微藻油脂快速測定的方向和重點。針對這些問題研究者可以通過對染料本身進行改性，在不改變其自身的光學性質(zhì)情況下，增強其穩(wěn)定性，同時減少熒光淬滅；此外，可以通過結(jié)合化學計量學方法解決紅外光譜檢測結(jié)果的重復性問題。然而在實際操作中，即使對單一測定方法進行了優(yōu)化和改進，仍然會存在一定的局限性。因此，若未來在微藻油脂的高通量測定過程中能在優(yōu)化的基礎(chǔ)上再通過與多種方法相結(jié)合，優(yōu)勢互補，以滿足不同實驗過程的測定需求，從而建立起一套快速、科學、高效的微藻油脂高通量測定方法，以加快高油脂含量微藻藻株的選育過程及提高微藻生物柴油的生產(chǎn)性能，微藻生物柴油工業(yè)將具有廣泛的應(yīng)用前景。

表1 本文所介紹方法的優(yōu)缺點、準確性及適用范圍比較