徐美迪，木蘭，牛超

1.內蒙古醫(yī)科大學，內蒙古 呼和浩特010110；

2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 環(huán)境醫(yī)學與作業(yè)醫(yī)學研究所，天津300050

環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術由Notomi等[1]于2000年創(chuàng)建，是一種在等溫條件下即可對靶序列進行快速、特異、靈敏檢測的核酸擴增技術。基于以上諸多優(yōu)勢，LAMP技術現(xiàn)已廣泛用于核酸檢測相關領域，如病原體識別、性別鑒定及食品檢測等。

1 LAMP技術概況

環(huán)介導等溫擴增技術的基本原理是，當目的DNA解鏈后,針對靶基因設計的4條特異性內外引物分別識別到相應互補位點，再利用BstDNA聚合酶在65℃等溫條件下對其進行延伸，先形成一個兩尾端各自互補的啞鈴樣DNA結構，隨后，在此基礎上不斷地被引物識別、延伸和擴增，最終生成由一系列反向重復的目的基因構成的莖環(huán)樣結構和多環(huán)花椰菜樣結構組成的DNA片段混合物[2]，整個體系于1 h內即可實現(xiàn)對目的片段的高效特異擴增。此外，Nagamine等[3]在LAMP體系中添加了2條環(huán)引物，使得LAMP反應時間縮短近一半，大大提高了擴增效率。環(huán)引物也是通過與莖環(huán)結構結合啟動鏈置換DNA合成，所有莖環(huán)DNA或與內引物雜交，或與環(huán)狀引物雜交，從而提高了檢測效率。LAMP結果可通過2%瓊脂糖凝膠電泳、添加染料、觀察濁度等方法進行判讀。首先，在擴增結束后，可將產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，通過觀察階梯狀條帶的有無來判斷結果。但由于電泳時致癌物質溴化乙錠的加入及開蓋加樣后氣溶膠的污染，使得此方法并不是檢測LAMP結果的首選方法。作為電泳的替代品，鈣黃綠素、SYBR greenⅠ和HNB染料等不僅遠離了致癌物，還實現(xiàn)了對DNA產(chǎn)物的直接檢測。鈣黃綠素是一種在反應前添加的染料，含有金屬離子結合熒光團，可使陽性反應體系在紫外光（365 nm）[4]下發(fā)出熒光，在自然光下發(fā)生顏色變化（橙色到綠色），從而大大提高了對結果判斷的準確性。SYBR greenⅠ的加入會使陽性反應體系出現(xiàn)紅橙色至黃綠色的顏色變化，且在紫外光下發(fā)出熒光。盡管其具有良好的靈敏度，但在擴增前加入，可抑制LAMP反應進行；在擴增結束后加入，開蓋又易造成假陽性結果[5]，因此并不利于其廣泛使用。由原理可知，隨著LAMP反應的不斷進行，副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀會逐漸增加，基于此特點，LAMP可通過肉眼觀察白色沉淀的方法對結果進行直接判讀；若使用實時濁度計進行反應，如Loopamp（Eiken Chemical公司）的LA-200、LA-320及LA-500等，還可實現(xiàn)對結果的實時監(jiān)測。

LAMP作為一種新型核酸檢測技術，有幾點優(yōu)勢尤為突出。首先，與傳統(tǒng)PCR技術相比，LAMP體系中的4條引物須分別與靶基因的6個或8個特異區(qū)完全匹配后才能反應；而PCR體系僅需上下游各1條引物與靶基因匹配即可，這意味著LAMP具有更高的特異性[2]。此外，LAMP檢測效率較高。在LAMP反應起始階段無須DNA模板的熱變性過程，從而縮短了反應起始時間；由于LAMP擴增模板呈啞鈴狀結構，含多個擴增起始點，可同時進行擴增，因此提高了擴增效率。PCR需要至少90 min才能完成的擴增反應，LAMP僅需30 min，大大節(jié)約了檢測時間。LAMP最突出的優(yōu)勢在于檢測方便，結果易判讀。由于LAMP是一種等溫擴增技術，僅需一個能保持恒定溫度的水浴鍋或加熱塊即可進行反應，因此降低了對儀器的要求。檢測結果可簡單地通過肉眼觀察有無白色沉淀進行判斷，無須再進行繁瑣的電泳實驗來驗證，降低了終點檢測對儀器的要求。另外，介于BstDNA聚合酶在緩沖溶液中的特性，Tanner等[6]開發(fā)了一種用于LAMP的新型pH敏感染料。隨著LAMP反應進行，會出現(xiàn)顯著的pH值變化，pH指示劑染料的加入即可輕松地監(jiān)測到LAMP反應是否進行，這一研究有助于LAMP作為便捷檢測工具在發(fā)展中國家的應用。此外，有研究表明，LAMP檢測并不受樣品中非靶標DNA[7]、PCR抑制劑（如血液）及未處理樣品[8]的影響，體現(xiàn)出LAMP具有極高的穩(wěn)定性。

2 在致病性微生物檢測中的應用

2.1 檢測致病性細菌

近年來，LAMP技術已廣泛應用于快速檢測致病性細菌，方法較為成熟，如空腸彎曲桿菌[9]、傷寒沙門菌[10]、腦膜炎奈瑟菌[11]和李斯特菌[12]等。Bakhtiari[13]通過靶向幽門螺桿菌ureC基因設計特異性引物建立了LAMP體系，檢測限與PCR測定的相同，為10 fg DNA（6個拷貝數(shù)）。一般情況下，實際樣品中的微生物種類和數(shù)量是未知的，因此，有必要對多種未知微生物進行同時檢測。由原理可知，LAMP擴增產(chǎn)物是長度不等的DNA混合片段，常規(guī)檢測只能判斷有無擴增反應發(fā)生而無法特異辨別擴增產(chǎn)物的來源。為了實現(xiàn)對多種致病微生物的特異檢測，現(xiàn)已開發(fā)出一系列以LAMP為基礎的多重LAMP（multiplex LAMP，mLAMP）[14]技術，以滿足快速檢測多種未知致病微生物的需求。Lee等[15]通過LAMP-PCR、雜交、限制性內切核酸酶消化及ELISA比色法，在單管內同時檢測了對異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素有抗性的多種結核分枝桿菌。Liu等[16]建立了用于檢測沙門菌和副溶血性弧菌的多重LAMP，通過調整沙門菌引物組的濃度解決了LAMP選擇性擴增問題，同時利用2種產(chǎn)物之間擴增曲線及熔解溫度的不同實現(xiàn)了對這2種病原體的特異檢測。Duarte[17]將mLAMP與芯片結合，實現(xiàn)了對hlyA（單增李斯特菌）、stx2（大腸桿菌O157）和in?vA（沙門菌）等3種靶基因的同時檢測，最低檢測限為105CFU/mL。盡管檢測的靈敏度不高，但實現(xiàn)了對多種菌株的同時檢測。此外，檢測過程中進樣、控溫及結果鑒定完全由儀器完成，更適合于大規(guī)模的樣品檢測。

2.2 檢測致病性病毒

逆轉錄環(huán)介導等溫擴增（reverse transcrip?tion LAMP，RT-LAMP）技術是通過在LAMP體系中加入逆轉錄酶來實現(xiàn)一步法檢測RNA病毒的核酸擴增技術[18]。與RT-PCR相同，RT-LAMP也是先利用逆轉錄酶合成與RNA互補的DNA，隨后在DNA聚合酶的作用下，對剛剛合成的DNA進行不斷的擴增，最終達到高效率擴增RNA病毒的目的。目前，針對丙型肝炎病毒[19]、登革熱病毒[20]、埃博拉病毒[21]、寨卡病毒[22]和中東呼吸綜合征冠狀病毒[23]等都已建立了RT-LAMP體系，其中，用于診斷埃博拉病毒[24]的LAMP試劑盒已被制成便攜式設備，廣泛用于現(xiàn)場檢測。目前，RT-LAMP最成功的用途之一是檢測人免疫缺陷病毒（HIV）。Ocwieja等[25]建立了用于診斷HIV蟄伏階段的RT-LAMP技術；Damhorst等[26]將數(shù)字設備與RT-LAMP相結合，通過智能手機即可觀察到全血中HIV-1的感染情況，檢測限為每微升全血670個病毒，該數(shù)字化RT-LAMP技術可輔助初級保健機構對HIV感染人群的篩查及基層實驗室對HIV檢測結果的判讀。此外，RT-LAMP也可用于檢測動植物病毒。Batai病毒（BATV）是一種由蚊子傳播，且可導致反芻動物先天性缺陷的病毒。Liu等[27]針對BATV的M基因建立了RT-LAMP體系并對其進行優(yōu)化。研究表明，RT-LAMP僅需40 min完成的Batai病毒檢測，RT-PCR需數(shù)小時才能完成；且RT-LAMP靈敏度低至每微升2.86個拷 貝，比qRT-PCR高 約100倍。Peng等[28]通 過靶向蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）的衣殼蛋白基因建立了RT-LAMP檢測體系。與RT-PCR（2.29 μg/μL）相比，該體系在64℃下可檢測低至0.02 μg/μL的病毒，靈敏度提高了100倍。該體系的建立實現(xiàn)了對蘋果褪綠葉斑病毒的現(xiàn)場檢測，控制了ACLSV的傳播。同時，多重LAMP體系也可應用于病毒檢測。Lau等[29]建立了用于檢測登革熱病毒的單管RT-mLAMP體系。研究中，針對登革熱病毒的每種血清型設計了各自的LAMP引物組，分別靶向DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的3'端非編碼區(qū)，并將所有引物添加到含有羥基萘酚藍（HNB）的單管LAMP體系中反應60 min，最終通過肉眼觀察顏色變化來確定檢測樣品中是否存在登革熱病毒。實驗中未觀察到與其他相關蟲媒病毒之間存在交叉反應，且此方法的靈敏度較高。

2.3 檢測致病性寄生蟲

原生動物寄生蟲同樣對人類有害。Nzelu[30]建立了檢測利什曼原蟲的LAMP體系，并利用122份臨床可疑樣品對其進行測試，結果顯示LAMP體系能夠有效檢測到101個DNA拷貝。Poole等[31]針對RF4基因建立了檢測羅阿絲蟲的高靈敏LAMP體系，且在30 min內即可完成對微絲蚴的檢測，解決了野外快速檢測難和寄生蟲感染早期管理難等諸多難題。此外，有研究將mLAMP與斑點酶聯(lián)免疫吸附法相結合，實現(xiàn)了對豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲牛帶絳蟲的區(qū)分。實驗中，根據(jù)細胞色素c氧化酶亞基1基因設計特異性引物，并對引物進行了標記（洋地黃毒苷、異硫氰酸熒光素和四甲基羅丹明標記FIP引物、生物素標記BIP引物），最終通過觀察膜上的紫色點有無來判斷檢測結果，從而實現(xiàn)對這些物種的差異性檢測[32]。Mwendwa等[33]建立了檢測溶組織內阿米巴的LAMP體系，體系中加入可加快反應速度的環(huán)狀引物，使得反應時間縮短了約11 min。為了評估其靈敏度，實驗中將此方法與標準的LAMP和PCR方法相比較，同時對臨床樣品中溶組織內阿米巴的DNA進行檢測，靈敏度分別是10-7（～30 pg/mL）、10-5（～3 ng/mL）和10-4（～30 ng/mL），可以看出，加入環(huán)狀引物的LAMP體系不僅加快了反應速率，還提高了整個體系的靈敏度。

2.4 檢測致病性真菌

真菌的常規(guī)檢測方法費力且昂貴。目前，一項用于檢測白色念珠菌、新型隱球菌和毛霉菌等真菌的mLAMP技術已由Nakayama等[34]建立。Karakkat等[35]針對冷季型草坪草的3種常見真菌根病原體建立了LAMP體系。此外，Luo等[36]分別針對黃曲霉、集蜂曲霉和凱氏曲霉的靶基因設計了各自的特異性引物，建立了定量檢測3種真菌的實時LAMP體系。

綜上所述，LAMP技術的應用明顯提高了檢測致病性微生物的靈敏度，縮短了檢測時間，簡化了操作步驟，為致病性微生物的檢測帶來了極大便利，體現(xiàn)了LAMP技術在生物安全檢測領域極大的應用價值。

3 新型LAMP

為了進一步滿足現(xiàn)場檢測和基層醫(yī)療單位對檢測技術的要求，在目前LAMP、mLAMP及與其他檢測技術相結合的基礎上，一些新型LAMP被逐漸開發(fā)出來。

3.1 電子LAMP

Salinas等[37]開發(fā)了電子LAMP技術，可通過Tk圖形界面對LAMP引物與靶序列的匹配度進行快速測試，有助于快速確定現(xiàn)有引物檢測變異體序列的效率和概率。

3.2 應用OmniAmp聚合酶的LAMP

OmniAmp聚合酶有著與Bst3.0聚合酶相似的活性，可對DNA和RNA進行直接檢測。Chander等[38]利用OmniAmp聚合酶，針對6種RNA病毒建立了新型RT-LAMP檢測方法。結果顯示，與傳統(tǒng)的Bst聚合酶相比，OmniAmp聚合酶熱穩(wěn)定性更高，受全血成分的抑制作用更小，用于低病毒血癥樣品檢測的速度更快，在環(huán)境溫度下可儲存的時間更長，且有著可增加逆轉錄酶活性的強大性能?；谶@些優(yōu)勢，OmniAmp聚合酶更適合用于側流裝置、凍干LAMP及現(xiàn)場裝置的開發(fā)[39]。

3.3 免疫橫向流動檢測

免疫橫向流動檢測（lateral flow assay，LFA）是LAMP的一種常用配套手段，由于其具有成本低、人性化、簡單、快速、便攜等優(yōu)勢，目前備受歡迎。Huang等[40]通過結合由異硫氰酸酯標記的DNA探針中的熒光素和生物素化的LAMP擴增子建立了橫向流速測定，在測試線上即可觀察到檢測結果。Yin等[41]利用多重LFA-LAMP實現(xiàn)了對金黃色葡萄球菌sea和seb基因的同時檢測。此外，免疫橫向流動檢測已可用于檢測麻疹病毒[42]、巴貝蟲病[43]、惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲[44]等。

3.4 凍干LAMP和LAMP試劑盒

基于現(xiàn)場檢測的需求，現(xiàn)已開發(fā)出多種形式的LAMP，如凍干狀態(tài)LAMP試劑和用于特異性檢測微生物的試劑盒。凍干LAMP試劑呈干燥粉末狀，可在環(huán)境溫度下長期儲存，更適于現(xiàn)場檢測。Hayashida[45]利用單管凍干LAMP檢測到了非洲錐蟲病。研究顯示，靶向重復插入移動元件（RIME）、18S rRNA和SRA-LAMP的檢測限分別為0.01、0.1和1個寄生蟲當量DNA，且與普通的LAMP試劑熱穩(wěn)定性相同。Chen等使用凍干LAMP及靶向lipL32和lipL41基因的引物組檢測到了鉤端螺旋體。該研究分別使用不同溫度（4℃、25℃和37℃）儲存的凍干LAMP和普通LAMP試劑對鉤端螺旋體進行檢測，并對檢測方法的穩(wěn)定性和靈敏度進行了評估。結果顯示，各方法的檢測限均為12拷貝基因組DNA，且穩(wěn)定性相近[46]。Carter等利用RT-LAMP凍干法檢測到了扎伊爾埃博拉病毒（ZEBOV），強調了通過關鍵修飾反應組分來保持凍干試劑穩(wěn)定的重要性[47]。LAMP試劑盒（如Loopamp TB檢測試劑盒、布氏錐蟲檢測試劑盒、單核細胞增生李斯特菌檢測試劑盒、軍團菌篩選試劑盒E、瘧疾檢測試劑盒、SARS冠狀病毒檢測試劑盒、彎曲桿菌檢測試劑盒、肺炎支原體檢測試劑盒、大腸桿菌O157檢測試劑盒、隱孢子蟲檢測試劑盒等）和LAMP引物組（如針對西尼羅病毒、禽流感H5和H7病毒、FluA流感病毒等的引物）均可從Eiken Chemical公司購買。

4 結語

作為一種新興的核酸擴增技術，LAMP現(xiàn)已廣泛應用于微生物檢測。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，LAMP具有高靈敏度、高特異性、低成本、簡單操作等諸多優(yōu)勢。目前，應用LAMP的中國食品檢測標準已生成，如進出口食品中致病菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法及出口食品中轉基因成分環(huán)介導等溫擴增檢測方法等。盡管LAMP技術已被廣泛使用，但也存在一些不足。在引物設計方面，雖然可以應用免費的在線軟件進行設計，但由于其是針對較短靶序列中的6～8個區(qū)域設計4～6條引物，在某些情況下，一些擴增效率較高的靶位點可能會被忽略，因此，應手動進行引物設計[48]，而且LAMP的超長DNA終產(chǎn)物并不適用于克隆或其他分子生物學的研究[4]。在mLAMP體系中，同時使用多組引物會增加引物間雜交的幾率，導致非特異性擴增[49]。出現(xiàn)上述現(xiàn)象，建議重新設計引物。LAMP體系擴增效率極高，并且產(chǎn)物極其穩(wěn)定，不易降解，因此易發(fā)生攜帶污染，出現(xiàn)假陽性的結果[50]。若出現(xiàn)上述情況，建議換用專用的移液管和過濾好的槍頭在超凈臺中進行實驗。此外，LAMP體系對微量污染物非常靈敏，一些開管操作，如進行瓊脂糖凝膠電泳，應在單獨房間內操作，以避免氣溶膠污染。當僅用比濁和比色法確定LAMP反應結果時，由于個體對顏色的主觀感知不同，結果可能會出現(xiàn)偏差[51]。和PCR不同，LAMP擴增產(chǎn)物電泳后呈階梯形條帶或拖尾現(xiàn)象，難以通過條帶大小來識別LAMP檢測目標物[52]。

為了更好地應用到基層實驗室和野外檢測，LAMP技術還須進一步完善與優(yōu)化，比如將mLAMP技術與芯片、數(shù)字核酸技術相聯(lián)合等?；贚AMP技術良好的應用前景，希望在不久的將來，LAMP技術可與其他新的檢測技術相結合，逐漸替代傳統(tǒng)微生物檢測技術，為生物安全提供更多保障。