王愷，趙海鑫，李金亮，夏晴

國家生物醫(yī)學分析中心，北京100850

腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）是重要的細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，作為能量載體為幾乎所有的細胞生命活動提供能量，同時，ATP也是一種重要的信號分子，參與細胞內(nèi)和從細胞外到細胞內(nèi)的信號傳遞[1-2]。在缺氧、病原體感染引起的細胞凋亡和組織損傷情況下，ATP可由細胞釋放至胞外作為一種危險信號參與信息傳遞，并且，有報道在化療或某些物理治療時，壞死的腫瘤細胞會將胞內(nèi)ATP釋放到微環(huán)境中，引起周圍腫瘤細胞和微環(huán)境中巨噬細胞的響應[3-4]。因此，深入研究細胞對外部環(huán)境中ATP刺激的響應，對于理解胞外ATP這一危險信號在某些組織損傷情況下的信號傳遞作用、腫瘤細胞內(nèi)部生命活動與外部環(huán)境的聯(lián)系，以及腫瘤細胞響應微環(huán)境物質刺激的方式具有重要意義。

細胞外ATP可通過刺激細胞膜上的嘌呤類受體P2X7分子，引起細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的改變，從而引起細胞的免疫反應和代謝狀態(tài)改變等[3,5-6]。鈣離子是機體各種生理活動必不可少的離子，參與膜電勢維持、神經(jīng)傳導、能量生產(chǎn)等重要的生理生化過程。同時，鈣離子作為一種細胞內(nèi)廣泛存在的第二信使，參與了細胞內(nèi)外的信號轉導和信息傳遞[7]。

在本研究中，我們采用胞漿和線粒體定位鈣探針GCaMP6的腺病毒分別感染人宮頸癌細胞HeLa[8-9]，驗證感染成功率和表達情況，研究在外源ATP刺激下HeLa細胞內(nèi)部鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變，希望為觀察細胞內(nèi)不同結構組分鈣離子的動態(tài)變化提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌HeLa細胞系購自American Type Culture Collection（ATCC）；DMEM基礎培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗（青霉素、鏈霉素）購自邁晨科技有限公司（北京）；胎牛血清、Opti-MAM培養(yǎng)基購自Gibco公司；Lab-Tek八腔室蓋玻片、ATP購自Thermo Fisher公司；Krebs-Ringer改良緩沖液（KRB）（125 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L Na3PO4，1 mmol/L MgSO4，5.5 mmol/L葡萄糖，20 mmol/L HEPES，pH7.4）為實驗室自行配制；全長線粒體鈣探針DNA來自意大利Padua大學Diego De Stefani實驗室；cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6鈣探針腺病毒為本實驗室構建；P2X7受體拮抗劑A438079來自Selleck公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

HeLa細胞用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在5%二氧化碳條件下，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 腺病毒感染

將HeLa細胞用胰蛋白酶消化后，用DMEM培養(yǎng)基重懸并計數(shù)，按3×104/孔的數(shù)量均勻種在Lab-Tek八腔室蓋玻片中，待細胞完全貼壁并狀態(tài)良好時，每孔更換為200μL新鮮DMEM培養(yǎng)基，加入10μL腺病毒濃縮液，置于37℃培養(yǎng)箱中，6 h后更換為新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 倒置熒光顯微鏡下觀察熒光探針表達情況

在腺病毒感染細胞24 h后，將細胞置于倒置熒光顯微鏡下，在波長為488 nm的激發(fā)光下觀察細胞的發(fā)光情況，從而確定腺病毒感染效率和熒光探針表達效果。

1.5 鈣離子熒光探針動態(tài)成像

將轉染熒光探針腺病毒的HeLa細胞更換培養(yǎng)基，用生理鹽水洗3次以去除原有的DMEM培養(yǎng)基，每孔加入300μL預熱的KRB，在Ultra?VIEW spinning-disc confocal microscope（Perkin Elmer）熒光成像系統(tǒng)下觀察，激發(fā)光波長488 nm，按3 s/幀的間隔連續(xù)拍攝。用Volocity軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，每組統(tǒng)計細胞數(shù)n=20。

1.6 ATP刺激下細胞鈣離子動態(tài)成像

將種植于Lab-Tek八腔室蓋玻片中的待觀察細胞更換培養(yǎng)基，用生理鹽水清洗3次后每孔加入150μL預熱的KRB，于共聚焦熒光顯微鏡成像系統(tǒng)下，以3 s/幀的間隔拍攝30 s，提前用預熱的KRB稀釋ATP至目標濃度，快速向對應腔室細胞滴加150μL終濃度為10μmol/L的ATP溶液，繼續(xù)拍攝。對于需要進行抑制劑預處理的細胞，在拍攝前1 h即更換含有10μmol/L A438079的KRB預處理，其他操作一致。用Volocity軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，每組統(tǒng)計細胞數(shù)n=20。

2 結果

2.1 腺病毒感染后熒光探針在相應細胞結構中得到表達

按照標準腺病毒轉染步驟進行操作，將cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6這2種不同定位的鈣探針腺病毒感染HeLa細胞，24 h后在倒置顯微鏡下初步觀察，在共聚焦熒光顯微鏡下拍攝確認。結果顯示，感染cyto-GCaMP6腺病毒后，HeLa細胞內(nèi)熒光探針GFP信號定位于胞漿，信號較強，細胞維持良好的生長狀態(tài)；感染4mt-GCaMP6腺病毒后，HeLa細胞線粒體絲網(wǎng)狀結構有明顯的GFP信號表達，細胞生長狀態(tài)良好（圖1）。

2.2 細胞外ATP刺激HeLa細胞胞漿發(fā)生瞬時鈣瞬變

在共聚焦熒光顯微鏡下對感染了cyto-GCaMP6腺病毒的HeLa細胞進行動態(tài)成像，我們發(fā)現(xiàn)在對細胞加入10μmol/L外源ATP刺激時，細胞內(nèi)綠色熒光信號在6 s內(nèi)發(fā)生約10倍的瞬時增強，持續(xù)約200 s后逐漸回落到基礎水平。這說明，HeLa細胞能夠響應細胞外ATP的刺激，從而發(fā)生胞漿鈣離子濃度的瞬時上升即胞漿鈣瞬變[10]，這可能是HeLa細胞對細胞外ATP刺激的一種響應機制（圖2）。

2.3 細胞外ATP的加入刺激HeLa細胞線粒體發(fā)生瞬時鈣瞬變

同上，在共聚焦熒光顯微鏡下對感染了4mt-GCaMP6腺病毒的HeLa細胞進行動態(tài)成像，在對細胞加入10μmol/L外源ATP刺激時，我們發(fā)現(xiàn)細胞線粒體綠色熒光信號強度在9 s左右發(fā)生大約4倍的瞬時上升即線粒體鈣瞬變，約300 s后熒光強度逐漸下降到較低水平（圖3）。已知，細胞線粒體內(nèi)鈣離子的來源主要是胞漿[11-12]，因此，此結果說明在ATP刺激下，HeLa細胞內(nèi)整體鈣離子穩(wěn)態(tài)會發(fā)生改變，線粒體會從胞漿攝入大量的鈣離子，引起線粒體內(nèi)鈣離子濃度的上調(diào)。

2.4 HeLa細胞通過細胞膜上的P2X7受體對細胞外ATP刺激進行鈣瞬變的響應

據(jù)報道，真核細胞細胞膜上存在核酸類物質的受體家族分子[13]，其中P2X7受體能夠結合ATP分子，從而將刺激信號轉導入細胞，引起胞內(nèi)的生理活動改變[5-6]。我們發(fā)現(xiàn)，用P2X7受體抑制劑A438079處理細胞后[14]，細胞生長狀態(tài)和熒光探針表達情況并不受影響，但是在ATP刺激下，細胞內(nèi)胞漿鈣離子濃度和線粒體鈣離子濃度的上升都受到了抑制（圖4）。這說明，細胞外ATP能夠通過HeLa細胞膜上的P2X7受體引起細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變。通過這種信號轉導機制，細胞能夠快速響應外界ATP的信號刺激。

圖1 胞漿鈣探針cyto-GCaMP6（A）與線粒體鈣探針4mt-GCaMP6（B）在HeLa細胞中的表達

3 討論

作為一種重要的信號分子，鈣離子對很多器官和組織細胞內(nèi)的生理活動具有關鍵的調(diào)控作用。在受到外來刺激和內(nèi)環(huán)境變化刺激時，細胞內(nèi)鈣離子濃度會發(fā)生波動，從而引起細胞內(nèi)生理活動狀態(tài)的改變。已知細胞內(nèi)主要的鈣離子庫是內(nèi)質網(wǎng)和線粒體，內(nèi)質網(wǎng)的鈣離子可以通過釋放到胞漿從而被線粒體攝取，引起線粒體活性的變化，這對于線粒體能量代謝、形態(tài)維持、氧化狀態(tài)的調(diào)節(jié)具有重要意義[11]。

圖2 外源ATP刺激引起HeLa細胞胞漿鈣離子探針熒光信號瞬時上升

圖3 外源ATP刺激引起HeLa細胞線粒體鈣離子探針熒光信號瞬時上升

圖4 ATP受體通道抑制劑A438079處理抑制外源ATP刺激引起的胞漿鈣瞬變（A）和線粒體鈣瞬變（B）

在此工作中，我們用基因編碼鈣探針對細胞內(nèi)鈣離子進行研究，發(fā)現(xiàn)HeLa細胞可以對細胞外ATP刺激產(chǎn)生快速反應，發(fā)生瞬時的胞漿鈣瞬變和線粒體鈣瞬變。這說明，HeLa細胞可以通過改變細胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)對外界環(huán)境的ATP變化產(chǎn)生靈敏的反應，而這種能力是通過細胞膜上的P2X7受體介導的。研究表明在某些劇烈的細胞損傷條件例如放化療刺激下，死亡的腫瘤細胞會向外環(huán)境釋放出內(nèi)容物，這些細胞內(nèi)大量的ATP等核酸類物質也會出現(xiàn)在外環(huán)境中，被周圍的其他細胞所感應到，在病原體感染、組織損傷中，ATP作為危險信號，也介導了細胞炎癥性損傷應答[2-4,15]。本研究成功構建了能在活體細胞內(nèi)通過熒光探針實時監(jiān)測鈣離子響應胞外ATP刺激的細胞實驗體系，為進一步深入探究ATP等危險信號導致細胞的炎性損傷機制奠定了基礎。