陳芳，王蘭，張左兵

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原030006

叉頭框（forkhead box，F(xiàn)OX）家族是一個(gè)由具有保守的叉頭狀螺旋（forkhead，F(xiàn)KH）DNA結(jié)合域蛋白組成的轉(zhuǎn)錄因子家族[1]。FOXP3是目前在免疫調(diào)控領(lǐng)域研究最為熱門(mén)的FOX家族成員。在哺乳動(dòng)物中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg細(xì)胞）的發(fā)育和功能由編碼FOXP3蛋白的基因控制，大量研究表明，foxp3是Treg細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育及發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵分子，在誘導(dǎo)和維持免疫耐受及免疫抑制功能中具有決定性作用[2-4]。foxp3缺陷型小鼠模型發(fā)展為一種致死性自身免疫綜合征，其特征在于外周T細(xì)胞增殖增加，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)在多個(gè)器官中，并引起炎癥細(xì)胞因子的大量增加，導(dǎo)致在出生后1個(gè)月內(nèi)死亡[5-6]。其中一種Scurfy小鼠模型，因在foxp3基因中自發(fā)產(chǎn)生的移碼突變，導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)缺乏C端叉頭結(jié)構(gòu)域[5]。這些發(fā)現(xiàn)表明了FOXP3在免疫抑制功能中的關(guān)鍵作用。人類(lèi)罕見(jiàn)的自身免疫性疾病免疫調(diào)節(jié)異常、多發(fā)性內(nèi)分泌疾病和腸病、X-聯(lián)（IPEX）綜合征[5]患者中foxp3基因發(fā)生突變，可見(jiàn)FOXP3在預(yù)防自身免疫性疾病中的重要作用，但FOXP3在非哺乳動(dòng)物脊椎動(dòng)物免疫耐受性的控制中的研究尚不夠深入。近年來(lái)，已相繼從不同硬骨魚(yú)類(lèi)分離克隆了foxp3的cDNA序列[7-11]，其中包括斑馬魚(yú)foxp3的cDNA序列[12-13]。由于斑馬魚(yú)在演化過(guò)程中出現(xiàn)了染色體加倍事件，因此斑馬魚(yú)基因組數(shù)據(jù)顯示其有2個(gè)foxp3同源基因，即foxp3a和foxp3b[12-13]。Jia等制備了尼羅羅非魚(yú)FOXP3蛋白，并研究發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚(yú)FOXP3蛋白細(xì)胞表達(dá)模式相對(duì)保守，且主要定位于淋巴樣細(xì)胞，如外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）、胸腺、脾、頭腎、腎、腸、鰓等，在PBMC中主要定位于一些（不是所有）淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核[14]。斑馬魚(yú)foxp3a基因在斑馬魚(yú)胸腺和腎臟中高表達(dá)，但FOXP3A蛋白表達(dá)模式及其功能有待于進(jìn)一步研究。本研究中，我們選擇在胸腺和腎臟中富集程度較高的FOXP3A制備多克隆抗體[12]。在早期克隆得到的斑馬魚(yú)foxp3a基因cDNA序列基礎(chǔ)上，構(gòu)建pET-32a-s-foxp3a原核表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)斑馬魚(yú)foxp3a密碼子進(jìn)行優(yōu)化，融合表達(dá)重組蛋白，并制備了兔源多克隆抗體，為斑馬魚(yú)FOXP3蛋白生物學(xué)功能的研究提供了手段，為深入研究斑馬魚(yú)免疫耐受性的控制機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康家兔購(gòu)自太原科鑫畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)。斑馬魚(yú)成魚(yú)（AB系）飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)養(yǎng)殖水循環(huán)系統(tǒng)中，每日喂食2次，養(yǎng)殖系統(tǒng)為上海海圣斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)，水循環(huán)系統(tǒng)溫度維持在（28±0.5）℃，按14 h/10 h晝夜節(jié)律條件飼養(yǎng)。

克隆宿主大腸桿菌DH5α、表達(dá)宿主大腸桿菌Trans BL21（DE3）購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET-32a為本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T（Sim?ple）載體和T4DNA連接酶購(gòu)于TaKaRa公司；2×Easy-TaqDNA聚合酶購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購(gòu)于NEB有限公司（北京）；Ni-NTA His-Bind Resin購(gòu)于Novagen公司；彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、96孔板及EL-TMB顯色試劑盒購(gòu)于生工生物工程股份有限公司（上海）；SDS-PAGE組 分Tris-HCl（pH8.8、pH6.8）、30%丙烯酰胺購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購(gòu)于Sigma公司；羊抗兔IgG-HRP購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 foxp3a表達(dá)序列擴(kuò)增

以本實(shí)驗(yàn)室RACE擴(kuò)增得到的斑馬魚(yú)foxp3a基因序列為模板，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），并擴(kuò)增foxp3a基因序列，引物的5'端和3'端分別加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線標(biāo)出）。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃30 s，64℃30 s，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目的片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將含目的條帶的菌液送生工公司測(cè)序。

1.3 foxp3a表達(dá)序列優(yōu)化

根據(jù)大腸桿菌稀有密碼子選擇需要進(jìn)行優(yōu)化的位點(diǎn)3個(gè)，分別記為1、2、3號(hào)突變位點(diǎn)。這3個(gè)突變位點(diǎn)將目的基因片段分成4個(gè)區(qū)域，即1～4號(hào)區(qū)域，并且設(shè)計(jì)突變引物。將測(cè)序正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。以所提質(zhì)粒為模板，通過(guò)橋連PCR技術(shù)，先分別用對(duì)應(yīng)的引物擴(kuò)增1～4號(hào)區(qū)域。第1輪PCR反應(yīng)體系（50μL）包括2×EsTaqMasterMix 25μL，ddH2O 22μL，正、反向引物各1μL，模板1μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)熱2 min；5個(gè)循環(huán)［94℃30 s，68℃（退火做touch?down-1℃/循環(huán)）30 s，72℃30 s］；30個(gè)循環(huán)（94℃30 s，66℃30 s，72℃30 s）；72℃延伸7 min；16℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收目的條帶。再以第1輪擴(kuò)增后得到的1號(hào)、2號(hào)區(qū)域混合物為模板，以1號(hào)區(qū)域的正向引物及2號(hào)區(qū)域的反向引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增；同時(shí)以第1輪擴(kuò)增后得到的3號(hào)、4號(hào)區(qū)域混合物為模板，以3號(hào)區(qū)域的正向引物及4號(hào)區(qū)域的反向引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。

第2輪PCR反應(yīng)體系（50μL）包括2×EsTaqMasterMix 25μL，ddH2O 21μL，正、反向引物各1μL，模板［1（3）號(hào)區(qū)域］1μL，模板［2（4）號(hào)區(qū)域］1μL。反應(yīng) 程序：94℃2 min；5個(gè)循環(huán)［94℃30 s，68℃（退火做touchdown-1℃/循環(huán)）30 s，72℃40 s］；30個(gè)循環(huán)（94℃30 s，66℃30 s，72℃40 s）；72℃延伸7 min；16℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收目的條帶；最后用帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增目的基因。

第3輪PCR反應(yīng)體系（50μL）包括2×EsTaqMasterMix 25μL，ddH2O 21μL，正、反向引物各1μL，模板（1～2號(hào)區(qū)域）1μL，模板（3～4號(hào)區(qū)域）1μL。反應(yīng) 程序：94℃2 min；5個(gè)循環(huán)［94℃30 s，68℃（退火做touchdown-1℃/循環(huán)）30 s，72℃1 min］；30個(gè)循環(huán)（94℃30 s，66℃30 s，72℃1 min）；72℃延伸7 min；16℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收目的條帶。

1.4 foxp3a原核表達(dá)載體的構(gòu)建

回收PCR產(chǎn)物，將目的基因片段與pET-32a載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切（37℃，過(guò)夜），瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收目的片段，用T4DNA連接酶于4℃過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽(yáng)性克隆，送生工公司測(cè)序驗(yàn)證。構(gòu)建成斑馬魚(yú)foxp3a原核表達(dá)載體pET32a-sfoxp3a。

1.5 誘導(dǎo)pET-32a-foxp3a的原核表達(dá)

將重組載體pET-32a-s-foxp3a轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），涂于含氨芐青霉素（1 mg/mL）的平板，挑取單克隆于5 mL LB培養(yǎng)液中，200 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，150 r/min、16℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h，離心收集菌體，1×PBS緩沖溶液重懸菌體，在冰浴條件下超聲波破碎（超聲時(shí)間2 s，間歇時(shí)間3 s，總時(shí)間2 h），10 000 r/min離心收集上清和沉淀，同時(shí)以誘導(dǎo)前菌液以及空載體菌液超聲波破碎離心所得上清和沉淀作為對(duì)照，行10% SDSPAGE，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色90 min，常溫過(guò)夜脫色，鑒定蛋白的表達(dá)。

1.6 包涵體融合蛋白的純化、多克隆抗體的制備及效價(jià)測(cè)定

超聲波破碎離心后的沉淀即為包涵體。每次用20 mL包涵體洗滌液（1% Triton X-100，5 mmol/L DTT，50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl）將包涵體清洗3次，4℃離心，棄上清，用20 mL包涵體溶解液（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，8 mol/L尿素，5%甘油）重懸沉淀，4℃靜置過(guò)夜溶解包涵體蛋白，12 000 r/min、4℃離心，取上清過(guò)0.45μm濾膜，用Ni-NTA His-Bind親和層析柱純化斑馬魚(yú)FOXP3A融合蛋白，選用10、20、50、100、250 mmol/L咪唑濃度洗脫，收集蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)。將純化的蛋白按500μg（1 mL）與1 mL弗氏完全佐劑混合乳化，乳化液對(duì)2只健康家兔（雌、雄各1只）于背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，14 d后用上述蛋白500μg（1 mL）與1 mL弗氏不完全佐劑乳化，對(duì)雌、雄2只家兔進(jìn)行首次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫共3次，間隔為7 d，最后一次加強(qiáng)免疫3 d后心臟取血并分離抗血清，分裝，-80℃保存。

表1 表達(dá)序列擴(kuò)增及基因優(yōu)化PCR引物列表

1.7抗斑馬魚(yú)S-FOXP3A-His多克隆抗血清效價(jià)測(cè)定

用間接ELISA法測(cè)定抗斑馬魚(yú)S-FOXP3AHis融合蛋白效價(jià)。將S-FOXP3A-His融合蛋白用包被液（2.94 g NaHCO3和1.59 g Na2CO3用雙蒸水定容至500μL，調(diào)節(jié)pH9.6，高壓蒸汽滅菌）稀釋至1μg/mL，100μL/孔包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜，棄去包被液，經(jīng)PBST洗滌、封閉緩沖液（10%小牛血清/PBS）封閉，再次洗滌后加入待檢物（斑馬魚(yú)FOXP3A-His多克隆抗體以及用PBS稀釋至不同濃度的免疫前血清），100μL/孔，孵育1 h后再次洗滌，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，100μL/孔，孵育1 h，1%小牛血清/PBS稀釋抗體，顯色后終止，用酶標(biāo)儀檢測(cè)D450nm值。S/N值＞2.1時(shí)判為陽(yáng)性（S為測(cè)定血清的D450nm值，N為陰性對(duì)照血清的D450nm值）。

2 結(jié)果

2.1 foxp3a基因優(yōu)化及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以成年斑馬魚(yú)腎臟、脾臟、肝臟、鰓、腸、胸腺及周?chē)M織混合cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在foxp3a預(yù)期大小894 bp附近有單一的目的條帶。將得到的基因序列片段與pMD19-T載體連接，構(gòu)建了重組克隆載體pMD19-T-simple-foxp3a。用含酶切位點(diǎn)的引物及突變引物進(jìn)行定點(diǎn)突變，3輪PCR結(jié)束后獲得與foxp3a預(yù)期大小909 bp一致的目的條帶（圖1A），將得到的基因序列片段與經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后的pET-32a載體連接，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-32a-foxp3a。通過(guò)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證，在909 bp附近有單一目的條帶（圖1B）。送生工公司測(cè)序驗(yàn)證，除靶位點(diǎn)有預(yù)期突變外，在第540位堿基處有一個(gè)同義突變（A突變?yōu)镚），該突變后的密碼子UCG也是大腸桿菌所偏好的絲氨酸對(duì)應(yīng)的密碼子。因此，成功構(gòu)建了密碼子優(yōu)化后的重組原核表達(dá)載體pET-32a-s-foxp3a。

2.2 融合蛋白的表達(dá)與純化

通過(guò)摸索不同的誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)了FOXP3A融合蛋白的表達(dá)。FOXP3A融合蛋白缺失了叉頭結(jié)構(gòu) 域FOXP3的N端（S-FOXP3）（圖2），SDSPAGE結(jié)果顯示（圖3），重組菌經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，在包涵體中檢測(cè)到與預(yù)期大?。ㄏ鄬?duì)分子質(zhì)量51.7×103）一致的目的條帶，即FOXP3A融合蛋白。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，未誘導(dǎo)的重組菌包涵體中未檢測(cè)到相應(yīng)大小的FOXP3A。因此，可確定獲得了包涵體FOXP3A融合蛋白。進(jìn)一步用親和純化方法，通過(guò)梯度咪唑濃度洗脫，對(duì)FOXP3A融合蛋白進(jìn)行分離、純化。結(jié)果顯示，250 mmol/mL咪唑濃度洗脫時(shí)檢測(cè)到大量目的蛋白。電泳條帶的灰度分析表明，250 mmol/mL咪唑濃度洗脫液洗脫收集的蛋白純度在80%以上，達(dá)到了后續(xù)免疫實(shí)驗(yàn)的要求。

圖1 foxp3a密碼子優(yōu)化定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增及pET-32a-foxp3a重組載體的酶切鑒定

2.3 FOXP3A融合蛋白多克隆抗體的制備

用純化的FOXP3A融合蛋白免疫家兔，收集血清，制備斑馬魚(yú)FOXP3A蛋白的多克隆抗血清，ELISA法測(cè)定結(jié)果顯示雌兔和雄兔抗S-FOXP3AHis的效價(jià)均高于1.6×105（圖4）。

3 討論

Treg細(xì)胞是抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞的特化細(xì)胞亞群。體外功能研究已經(jīng)證實(shí)Treg細(xì)胞存在多種抑制機(jī)制，而且人類(lèi)[5]和小鼠Treg細(xì)胞缺陷型的研究已經(jīng)清楚地表明了這些細(xì)胞在預(yù)防自身免疫中的重要作用。Hori等的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子FOXP3特異性表達(dá)于Treg細(xì)胞上，并在該細(xì)胞的發(fā)育和功能維持中發(fā)揮重要作用[15]，而且在其他一些魚(yú)類(lèi)，如河豚[10]、大馬哈魚(yú)[11]、尼羅羅非魚(yú)[9]和兩棲類(lèi)[16]中也發(fā)現(xiàn)了編碼FOXP3直系同源基因，這表明FOXP3也可能在非哺乳動(dòng)物脊椎動(dòng)物定義Treg樣細(xì)胞。斑馬魚(yú)基因組數(shù)據(jù)顯示其有2個(gè)foxp3同源基因foxp3a和foxp3b，對(duì)foxp3的研究大部分處于mRNA水平。本研究制備了斑馬魚(yú)FOXP3A多克隆抗體，為在蛋白水平更好地探討FOXP3A的功能，深入研究轉(zhuǎn)錄因子FOXP3A在Treg細(xì)胞中的發(fā)育和功能提供了基礎(chǔ)。

圖2 FOXP3A功能結(jié)構(gòu)域圖解

圖3 FOXP3A融合蛋白的表達(dá)及純化

圖4 間接ELISA檢驗(yàn)抗S-FOXP3A-His血清效價(jià)

在斑馬魚(yú)FOXP3A蛋白多克隆抗體的制備過(guò)程中，首先擴(kuò)增斑馬魚(yú)foxp3a基因開(kāi)放讀框片段，用軟件翻譯產(chǎn)生氨基酸序列，通過(guò)BLAST進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，比較來(lái)自斑馬魚(yú)的FOXP3A和FOXP1A、FOXP1B、FOXP2及FOXP4的氨基酸序列，F(xiàn)OXP3A的N端片段顯示出對(duì)FOXP3A的高度特異性。FOXP家族的特征性叉頭結(jié)構(gòu)域C端顯示出與其他FOXP家族成員超過(guò)80%的相似性。因此，將叉頭結(jié)構(gòu)域缺失的FOXP3A的N端片段用作抗原。同時(shí)，在分析所選擇的這段基因序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)其含有大腸桿菌稀有密碼子，在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)若直接采用斑馬魚(yú)foxp3a天然核苷酸序列在大腸桿菌中表達(dá)，其表達(dá)水平較低。故在本研究中，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，在不改變氨基酸組成的情況下，將斑馬魚(yú)foxp3a基因中稀有密碼子更換為大腸桿菌宿主使用頻率較高的密碼子。采用重疊PCR的方式，設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，通過(guò)3輪PCR，合成了909 bp的目的片段。其次，在表達(dá)載體選擇上，pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆表達(dá)融合蛋白最強(qiáng)大的系統(tǒng)之一，本實(shí)驗(yàn)選擇了其中的原核表達(dá)載體pET-32a，T7為啟動(dòng)子，可使目的基因得到高效轉(zhuǎn)錄與翻譯，同時(shí)該載體含有6個(gè)連續(xù)的組氨酸標(biāo)記，以蛋白酶缺陷型大腸桿菌BL21（DE3）作為宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白可利用His標(biāo)簽進(jìn)行親和層析純化。本研究制備的斑馬魚(yú)SFOXP3A-His融合蛋白以包涵體形式表達(dá)，雖然不具有生物活性，但包涵體的形成能夠防止蛋白酶對(duì)表達(dá)的目的蛋白的降解作用，而且包涵體形式的目的蛋白有利于分離純化。間接ELISA法檢測(cè)其特異性多抗血清效價(jià)在1.6×105以上，說(shuō)明表達(dá)的重組蛋白具有很好的免疫原性，能刺激家兔產(chǎn)生高滴度的特異性抗體，為下一步制備其單克隆抗體打下了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。