陳芳,王蘭,張左兵
山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原030006
叉頭框(forkhead box,F(xiàn)OX)家族是一個(gè)由具有保守的叉頭狀螺旋(forkhead,F(xiàn)KH)DNA結(jié)合域蛋白組成的轉(zhuǎn)錄因子家族[1]。FOXP3是目前在免疫調(diào)控領(lǐng)域研究最為熱門(mén)的FOX家族成員。在哺乳動(dòng)物中,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg細(xì)胞)的發(fā)育和功能由編碼FOXP3蛋白的基因控制,大量研究表明,foxp3是Treg細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育及發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵分子,在誘導(dǎo)和維持免疫耐受及免疫抑制功能中具有決定性作用[2-4]。foxp3缺陷型小鼠模型發(fā)展為一種致死性自身免疫綜合征,其特征在于外周T細(xì)胞增殖增加,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)在多個(gè)器官中,并引起炎癥細(xì)胞因子的大量增加,導(dǎo)致在出生后1個(gè)月內(nèi)死亡[5-6]。其中一種Scurfy小鼠模型,因在foxp3基因中自發(fā)產(chǎn)生的移碼突變,導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)缺乏C端叉頭結(jié)構(gòu)域[5]。這些發(fā)現(xiàn)表明了FOXP3在免疫抑制功能中的關(guān)鍵作用。人類(lèi)罕見(jiàn)的自身免疫性疾病免疫調(diào)節(jié)異常、多發(fā)性內(nèi)分泌疾病和腸病、X-聯(lián)(IPEX)綜合征[5]患者中foxp3基因發(fā)生突變,可見(jiàn)FOXP3在預(yù)防自身免疫性疾病中的重要作用,但FOXP3在非哺乳動(dòng)物脊椎動(dòng)物免疫耐受性的控制中的研究尚不夠深入。近年來(lái),已相繼從不同硬骨魚(yú)類(lèi)分離克隆了foxp3的cDNA序列[7-11],其中包括斑馬魚(yú)foxp3的cDNA序列[12-13]。由于斑馬魚(yú)在演化過(guò)程中出現(xiàn)了染色體加倍事件,因此斑馬魚(yú)基因組數(shù)據(jù)顯示其有2個(gè)foxp3同源基因,即foxp3a和foxp3b[12-13]。Jia等制備了尼羅羅非魚(yú)FOXP3蛋白,并研究發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚(yú)FOXP3蛋白細(xì)胞表達(dá)模式相對(duì)保守,且主要定位于淋巴樣細(xì)胞,如外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、胸腺、脾、頭腎、腎、腸、鰓等,在PBMC中主要定位于一些(不是所有)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核[14]。斑馬魚(yú)foxp3a基因在斑馬魚(yú)胸腺和腎臟中高表達(dá),但FOXP3A蛋白表達(dá)模式及其功能有待于進(jìn)一步研究。本研究中,我們選擇在胸腺和腎臟中富集程度較高的FOXP3A制備多克隆抗體[12]。在早期克隆得到的斑馬魚(yú)foxp3a基因cDNA序列基礎(chǔ)上,構(gòu)建pET-32a-s-foxp3a原核表達(dá)系統(tǒng),對(duì)斑馬魚(yú)foxp3a密碼子進(jìn)行優(yōu)化,融合表達(dá)重組蛋白,并制備了兔源多克隆抗體,為斑馬魚(yú)FOXP3蛋白生物學(xué)功能的研究提供了手段,為深入研究斑馬魚(yú)免疫耐受性的控制機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
健康家兔購(gòu)自太原科鑫畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)。斑馬魚(yú)成魚(yú)(AB系)飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)養(yǎng)殖水循環(huán)系統(tǒng)中,每日喂食2次,養(yǎng)殖系統(tǒng)為上海海圣斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng),水循環(huán)系統(tǒng)溫度維持在(28±0.5)℃,按14 h/10 h晝夜節(jié)律條件飼養(yǎng)。
克隆宿主大腸桿菌DH5α、表達(dá)宿主大腸桿菌Trans BL21(DE3)購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;pET-32a為本實(shí)驗(yàn)室保存;pMD19-T(Sim?ple)載體和T4DNA連接酶購(gòu)于TaKaRa公司;2×Easy-TaqDNA聚合酶購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購(gòu)于NEB有限公司(北京);Ni-NTA His-Bind Resin購(gòu)于Novagen公司;彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、96孔板及EL-TMB顯色試劑盒購(gòu)于生工生物工程股份有限公司(上海);SDS-PAGE組 分Tris-HCl(pH8.8、pH6.8)、30%丙烯酰胺購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購(gòu)于Sigma公司;羊抗兔IgG-HRP購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司。
以本實(shí)驗(yàn)室RACE擴(kuò)增得到的斑馬魚(yú)foxp3a基因序列為模板,用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1),并擴(kuò)增foxp3a基因序列,引物的5'端和3'端分別加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)出)。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min;94℃30 s,64℃30 s,72℃1 min,共35個(gè)循環(huán);72℃終延伸7 min;瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目的片段與pMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),將含目的條帶的菌液送生工公司測(cè)序。
根據(jù)大腸桿菌稀有密碼子選擇需要進(jìn)行優(yōu)化的位點(diǎn)3個(gè),分別記為1、2、3號(hào)突變位點(diǎn)。這3個(gè)突變位點(diǎn)將目的基因片段分成4個(gè)區(qū)域,即1~4號(hào)區(qū)域,并且設(shè)計(jì)突變引物。將測(cè)序正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒。以所提質(zhì)粒為模板,通過(guò)橋連PCR技術(shù),先分別用對(duì)應(yīng)的引物擴(kuò)增1~4號(hào)區(qū)域。第1輪PCR反應(yīng)體系(50μL)包括2×EsTaqMasterMix 25μL,ddH2O 22μL,正、反向引物各1μL,模板1μL。反應(yīng)程序:94℃預(yù)熱2 min;5個(gè)循環(huán)[94℃30 s,68℃(退火做touch?down-1℃/循環(huán))30 s,72℃30 s];30個(gè)循環(huán)(94℃30 s,66℃30 s,72℃30 s);72℃延伸7 min;16℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),膠回收目的條帶。再以第1輪擴(kuò)增后得到的1號(hào)、2號(hào)區(qū)域混合物為模板,以1號(hào)區(qū)域的正向引物及2號(hào)區(qū)域的反向引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增;同時(shí)以第1輪擴(kuò)增后得到的3號(hào)、4號(hào)區(qū)域混合物為模板,以3號(hào)區(qū)域的正向引物及4號(hào)區(qū)域的反向引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。
第2輪PCR反應(yīng)體系(50μL)包括2×EsTaqMasterMix 25μL,ddH2O 21μL,正、反向引物各1μL,模板[1(3)號(hào)區(qū)域]1μL,模板[2(4)號(hào)區(qū)域]1μL。反應(yīng) 程序:94℃2 min;5個(gè)循環(huán)[94℃30 s,68℃(退火做touchdown-1℃/循環(huán))30 s,72℃40 s];30個(gè)循環(huán)(94℃30 s,66℃30 s,72℃40 s);72℃延伸7 min;16℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),膠回收目的條帶;最后用帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增目的基因。
第3輪PCR反應(yīng)體系(50μL)包括2×EsTaqMasterMix 25μL,ddH2O 21μL,正、反向引物各1μL,模板(1~2號(hào)區(qū)域)1μL,模板(3~4號(hào)區(qū)域)1μL。反應(yīng) 程序:94℃2 min;5個(gè)循環(huán)[94℃30 s,68℃(退火做touchdown-1℃/循環(huán))30 s,72℃1 min];30個(gè)循環(huán)(94℃30 s,66℃30 s,72℃1 min);72℃延伸7 min;16℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),膠回收目的條帶。
回收PCR產(chǎn)物,將目的基因片段與pET-32a載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切(37℃,過(guò)夜),瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收目的片段,用T4DNA連接酶于4℃過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選陽(yáng)性克隆,送生工公司測(cè)序驗(yàn)證。構(gòu)建成斑馬魚(yú)foxp3a原核表達(dá)載體pET32a-sfoxp3a。
將重組載體pET-32a-s-foxp3a轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3),涂于含氨芐青霉素(1 mg/mL)的平板,挑取單克隆于5 mL LB培養(yǎng)液中,200 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為1.0時(shí),加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,150 r/min、16℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h,離心收集菌體,1×PBS緩沖溶液重懸菌體,在冰浴條件下超聲波破碎(超聲時(shí)間2 s,間歇時(shí)間3 s,總時(shí)間2 h),10 000 r/min離心收集上清和沉淀,同時(shí)以誘導(dǎo)前菌液以及空載體菌液超聲波破碎離心所得上清和沉淀作為對(duì)照,行10% SDSPAGE,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色90 min,常溫過(guò)夜脫色,鑒定蛋白的表達(dá)。
超聲波破碎離心后的沉淀即為包涵體。每次用20 mL包涵體洗滌液(1% Triton X-100,5 mmol/L DTT,50 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl)將包涵體清洗3次,4℃離心,棄上清,用20 mL包涵體溶解液(20 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,8 mol/L尿素,5%甘油)重懸沉淀,4℃靜置過(guò)夜溶解包涵體蛋白,12 000 r/min、4℃離心,取上清過(guò)0.45μm濾膜,用Ni-NTA His-Bind親和層析柱純化斑馬魚(yú)FOXP3A融合蛋白,選用10、20、50、100、250 mmol/L咪唑濃度洗脫,收集蛋白,SDS-PAGE檢測(cè)。將純化的蛋白按500μg(1 mL)與1 mL弗氏完全佐劑混合乳化,乳化液對(duì)2只健康家兔(雌、雄各1只)于背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行基礎(chǔ)免疫,14 d后用上述蛋白500μg(1 mL)與1 mL弗氏不完全佐劑乳化,對(duì)雌、雄2只家兔進(jìn)行首次加強(qiáng)免疫,加強(qiáng)免疫共3次,間隔為7 d,最后一次加強(qiáng)免疫3 d后心臟取血并分離抗血清,分裝,-80℃保存。
表1 表達(dá)序列擴(kuò)增及基因優(yōu)化PCR引物列表
用間接ELISA法測(cè)定抗斑馬魚(yú)S-FOXP3AHis融合蛋白效價(jià)。將S-FOXP3A-His融合蛋白用包被液(2.94 g NaHCO3和1.59 g Na2CO3用雙蒸水定容至500μL,調(diào)節(jié)pH9.6,高壓蒸汽滅菌)稀釋至1μg/mL,100μL/孔包被酶標(biāo)板,4℃過(guò)夜,棄去包被液,經(jīng)PBST洗滌、封閉緩沖液(10%小牛血清/PBS)封閉,再次洗滌后加入待檢物(斑馬魚(yú)FOXP3A-His多克隆抗體以及用PBS稀釋至不同濃度的免疫前血清),100μL/孔,孵育1 h后再次洗滌,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG,100μL/孔,孵育1 h,1%小牛血清/PBS稀釋抗體,顯色后終止,用酶標(biāo)儀檢測(cè)D450nm值。S/N值>2.1時(shí)判為陽(yáng)性(S為測(cè)定血清的D450nm值,N為陰性對(duì)照血清的D450nm值)。
以成年斑馬魚(yú)腎臟、脾臟、肝臟、鰓、腸、胸腺及周?chē)M織混合cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在foxp3a預(yù)期大小894 bp附近有單一的目的條帶。將得到的基因序列片段與pMD19-T載體連接,構(gòu)建了重組克隆載體pMD19-T-simple-foxp3a。用含酶切位點(diǎn)的引物及突變引物進(jìn)行定點(diǎn)突變,3輪PCR結(jié)束后獲得與foxp3a預(yù)期大小909 bp一致的目的條帶(圖1A),將得到的基因序列片段與經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后的pET-32a載體連接,構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-32a-foxp3a。通過(guò)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證,在909 bp附近有單一目的條帶(圖1B)。送生工公司測(cè)序驗(yàn)證,除靶位點(diǎn)有預(yù)期突變外,在第540位堿基處有一個(gè)同義突變(A突變?yōu)镚),該突變后的密碼子UCG也是大腸桿菌所偏好的絲氨酸對(duì)應(yīng)的密碼子。因此,成功構(gòu)建了密碼子優(yōu)化后的重組原核表達(dá)載體pET-32a-s-foxp3a。
通過(guò)摸索不同的誘導(dǎo)條件,誘導(dǎo)了FOXP3A融合蛋白的表達(dá)。FOXP3A融合蛋白缺失了叉頭結(jié)構(gòu) 域FOXP3的N端(S-FOXP3)(圖2),SDSPAGE結(jié)果顯示(圖3),重組菌經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后,在包涵體中檢測(cè)到與預(yù)期大?。ㄏ鄬?duì)分子質(zhì)量51.7×103)一致的目的條帶,即FOXP3A融合蛋白。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中,未誘導(dǎo)的重組菌包涵體中未檢測(cè)到相應(yīng)大小的FOXP3A。因此,可確定獲得了包涵體FOXP3A融合蛋白。進(jìn)一步用親和純化方法,通過(guò)梯度咪唑濃度洗脫,對(duì)FOXP3A融合蛋白進(jìn)行分離、純化。結(jié)果顯示,250 mmol/mL咪唑濃度洗脫時(shí)檢測(cè)到大量目的蛋白。電泳條帶的灰度分析表明,250 mmol/mL咪唑濃度洗脫液洗脫收集的蛋白純度在80%以上,達(dá)到了后續(xù)免疫實(shí)驗(yàn)的要求。
圖1 foxp3a密碼子優(yōu)化定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增及pET-32a-foxp3a重組載體的酶切鑒定
用純化的FOXP3A融合蛋白免疫家兔,收集血清,制備斑馬魚(yú)FOXP3A蛋白的多克隆抗血清,ELISA法測(cè)定結(jié)果顯示雌兔和雄兔抗S-FOXP3AHis的效價(jià)均高于1.6×105(圖4)。
Treg細(xì)胞是抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞的特化細(xì)胞亞群。體外功能研究已經(jīng)證實(shí)Treg細(xì)胞存在多種抑制機(jī)制,而且人類(lèi)[5]和小鼠Treg細(xì)胞缺陷型的研究已經(jīng)清楚地表明了這些細(xì)胞在預(yù)防自身免疫中的重要作用。Hori等的研究表明,轉(zhuǎn)錄因子FOXP3特異性表達(dá)于Treg細(xì)胞上,并在該細(xì)胞的發(fā)育和功能維持中發(fā)揮重要作用[15],而且在其他一些魚(yú)類(lèi),如河豚[10]、大馬哈魚(yú)[11]、尼羅羅非魚(yú)[9]和兩棲類(lèi)[16]中也發(fā)現(xiàn)了編碼FOXP3直系同源基因,這表明FOXP3也可能在非哺乳動(dòng)物脊椎動(dòng)物定義Treg樣細(xì)胞。斑馬魚(yú)基因組數(shù)據(jù)顯示其有2個(gè)foxp3同源基因foxp3a和foxp3b,對(duì)foxp3的研究大部分處于mRNA水平。本研究制備了斑馬魚(yú)FOXP3A多克隆抗體,為在蛋白水平更好地探討FOXP3A的功能,深入研究轉(zhuǎn)錄因子FOXP3A在Treg細(xì)胞中的發(fā)育和功能提供了基礎(chǔ)。
圖2 FOXP3A功能結(jié)構(gòu)域圖解
圖3 FOXP3A融合蛋白的表達(dá)及純化
圖4 間接ELISA檢驗(yàn)抗S-FOXP3A-His血清效價(jià)
在斑馬魚(yú)FOXP3A蛋白多克隆抗體的制備過(guò)程中,首先擴(kuò)增斑馬魚(yú)foxp3a基因開(kāi)放讀框片段,用軟件翻譯產(chǎn)生氨基酸序列,通過(guò)BLAST進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì),比較來(lái)自斑馬魚(yú)的FOXP3A和FOXP1A、FOXP1B、FOXP2及FOXP4的氨基酸序列,F(xiàn)OXP3A的N端片段顯示出對(duì)FOXP3A的高度特異性。FOXP家族的特征性叉頭結(jié)構(gòu)域C端顯示出與其他FOXP家族成員超過(guò)80%的相似性。因此,將叉頭結(jié)構(gòu)域缺失的FOXP3A的N端片段用作抗原。同時(shí),在分析所選擇的這段基因序列時(shí),發(fā)現(xiàn)其含有大腸桿菌稀有密碼子,在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)若直接采用斑馬魚(yú)foxp3a天然核苷酸序列在大腸桿菌中表達(dá),其表達(dá)水平較低。故在本研究中,根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性,在不改變氨基酸組成的情況下,將斑馬魚(yú)foxp3a基因中稀有密碼子更換為大腸桿菌宿主使用頻率較高的密碼子。采用重疊PCR的方式,設(shè)計(jì)了4對(duì)引物,通過(guò)3輪PCR,合成了909 bp的目的片段。其次,在表達(dá)載體選擇上,pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆表達(dá)融合蛋白最強(qiáng)大的系統(tǒng)之一,本實(shí)驗(yàn)選擇了其中的原核表達(dá)載體pET-32a,T7為啟動(dòng)子,可使目的基因得到高效轉(zhuǎn)錄與翻譯,同時(shí)該載體含有6個(gè)連續(xù)的組氨酸標(biāo)記,以蛋白酶缺陷型大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)的重組蛋白可利用His標(biāo)簽進(jìn)行親和層析純化。本研究制備的斑馬魚(yú)SFOXP3A-His融合蛋白以包涵體形式表達(dá),雖然不具有生物活性,但包涵體的形成能夠防止蛋白酶對(duì)表達(dá)的目的蛋白的降解作用,而且包涵體形式的目的蛋白有利于分離純化。間接ELISA法檢測(cè)其特異性多抗血清效價(jià)在1.6×105以上,說(shuō)明表達(dá)的重組蛋白具有很好的免疫原性,能刺激家兔產(chǎn)生高滴度的特異性抗體,為下一步制備其單克隆抗體打下了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。