李素芬，郝西琳，王唯斯，嚴長寶，趙妤，余敏，熊偉

1.大理大學 基礎醫(yī)學院，云南 大理671000；2.大理白族自治州第一人民醫(yī)院 病理科，云南 大理671000；3.云南大學 生命科學學院，云南 昆明530061

線粒體是所有真核細胞的“動力工廠”，其主要功能是通過氧化磷酸化為細胞提供ATP，同時也參與物質代謝、細胞增殖、細胞凋亡和細胞衰老等過程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體呼吸鏈功能缺陷能夠累及機體的能量代謝、神經(jīng)傳遞、內環(huán)境平衡等，進而促進人類多種疾病的發(fā)生，如線粒體腦肌病、線粒體糖尿病、Leber遺傳性視神經(jīng)病變、耳聾、心肌病、惡性腫瘤及衰老等，統(tǒng)稱為線粒體相關疾病[2]。研究線粒體呼吸鏈缺陷發(fā)生的分子遺傳機制，可以進一步闡明線粒體相關疾病的病因并為臨床治療提供指導[3]。為了實現(xiàn)上述目的，需要建立一個特殊的細胞模型，它不含線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），使我們能夠將患者體細胞或生殖細胞內的mtDNA從一個細胞環(huán)境轉移到另一個細胞環(huán)境，或者將新的外源DNA引入線粒體，從而闡明線粒體基因突變或缺失在呼吸鏈功能缺陷中的作用及分子機制[4]。通常，人們將mtDNA缺失的細胞系稱為Rho0（ρ0）細胞系。我們以穩(wěn)定傳代的人肺腺癌A549細胞系為母本細胞，用低劑量溴化乙錠（ethidium bro?mide，EB）持續(xù)處理該細胞系，誘導mtDNA缺失，試圖建立ρ0A549細胞系。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌A549細胞系由瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學院實驗醫(yī)學系Anna Karlsson教授惠贈。

RPMI1640培養(yǎng)基、透析/普通胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；EB、丙酮酸鈉、尿嘧啶核苷、苯甲基磺酰氟（phenylmethane sulfonyfluoride，PMSF）等生化試劑購自Sigma公司；動物細胞基因組DNA快速提取試劑盒購自Qiagen公司；細胞裂解液、聚丙烯酰胺（PAGE）預制凝膠、4×蛋白質上樣緩沖液購自Invitrogen公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒購自Roche公司；TaqMan Real-time PCR Mas?ter Mixes購自Thermo Fisher公司；增強型化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自Millipore公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白質定量試劑盒購自Pierce公司；兔抗MT-COX1單抗（ab203912）、兔抗MT-ATP6多抗（ab192423）、兔抗SDHA單抗（ab137040）、兔抗ATP5A單 抗（ab176569）、兔 抗GAPDH單 抗（ab181602）、HRP標記的山羊抗兔IgG（ab6721）購自Abcam公司；qPCR引物和探針由昆明碩擎生物科技有限公司合成。

生物安全柜（蘇州凈化設備有限公司）；全自動高壓滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司）；QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR系統(tǒng)、全自動細胞計數(shù)儀（Life Tech公司）；CO2培養(yǎng)箱、Nanodrop ND1000核酸和蛋白質定量儀、MK3型全自動酶標儀（Thermo Fisher公司）；蛋白質電泳儀、Trans-Blot Turbo蛋白質轉印儀（Bio-Rad公司）；G:BOX F3化學發(fā)光及凝膠成像系統(tǒng)（Syngene公司）；BL150S型電子天平（Sartorius公司）；微量移液器（Biohit公司）。

1.2 構建無mtDNA的ρ0A549細胞系

按照文獻報道的方法[5]，將人肺腺癌ρ+A549細胞培養(yǎng)于含50 ng/mL EB、50μg/mL尿嘧啶核苷和100μg/mL丙酮酸鈉的RPMI1640完全培養(yǎng)基（含15%透析FBS）中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)液，每周傳代2次。連續(xù)培養(yǎng)35 d后，將細胞培養(yǎng)液換成含50 μg/mL尿嘧啶核苷、100μg/mL丙酮酸鈉、15%透析FBS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 相對熒光定量PCR（qPCR）檢測mtDNA拷貝數(shù)

收集處于對數(shù)生長期的野生型ρ+A549和ρ0A549細胞，用基因組DNA提取試劑盒提取細胞內總DNA。參照文獻方法[6]，采用TaqMan探針法進行qPCR，以細胞核編碼APP基因為內參照基因，擴增線粒體基因組D-loop區(qū)來檢測mtDNA拷貝數(shù)的變化，引物序列和探針序列見表1。實驗重復3次。

1.4 Western印跡檢測蛋白質表達水平

收集處于對數(shù)生長期的野生型ρ+A549和ρ0A549細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定各組的蛋白質濃度[7]。每個泳道分別加入50μg蛋白質樣品，行12% SDS-PAGE，電泳分離后將凝膠上的蛋白質用半干轉印法（20 V，7 min）轉移至PVDF膜上；將PVDF膜用含5%脫脂奶粉的PBST于室溫封閉1 h，分別滴加一抗（1∶1000稀釋），4℃孵育過夜；用PBST洗膜3次，每次5 min，洗膜結束后滴加相應的二抗（1∶5000稀釋），室溫孵育2 h；用PBST再次洗膜3次，每次5 min；用ECL發(fā)光液顯影并采集圖像。用Image Lab 5.2.1軟件分析各條帶累積光密度值（integral optical density，IOD），統(tǒng)計2組細胞中蛋白質相對表達量。實驗重復3次。

1.5 MTT法測定細胞增殖曲線

收集處于對數(shù)生長期的野生型ρ+A549和ρ0A549細胞，其中ρ0A549細胞用含100μg/mL丙酮酸鈉、50μg/mL尿嘧啶核苷、10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將2組細胞分別制成單細胞懸液并計數(shù)，調整細胞濃度為2×104/mL，96孔板中每孔加入100μL細胞懸液，即每孔2000個細胞，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁，培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后，每孔加入20μL MTT溶液（5 mg/mL）后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄培養(yǎng)液后，每孔加入150μL二甲基亞砜溶解結晶，于搖床上低速振蕩15 min，待結晶物充分溶解后，用酶標儀測定各孔的D570nm值。實驗重復3次。

表1 熒光定量PCR引物和探針序列

1.6 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 21.0和Graphpad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析和繪圖，計量資料結果以x±s表示，2組間均數(shù)比較采用獨立樣本Student'st檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ρ0A549細胞的形態(tài)學鑒定

普通倒置顯微鏡下觀察，低劑量EB誘導35 d后，ρ0A549細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈拉長枝狀，長徑與短徑比值大于5；而未經(jīng)EB誘導的野生型ρ+A549細胞呈多角形，長徑與短徑比值小于5（圖1）。且ρ0A549細胞生長速度明顯慢于野生型ρ+A549細胞，野生型ρ+A549細胞傳代時間為2～3 d，ρ0A549細胞傳代時間為5 d，符合腫瘤失去有氧代謝途徑后在低氧下生長的一般規(guī)律。

2.2 qPCR檢測結果

以細胞核基因組（nDNA）APP基因為內參照，擴增mtDNA的D-loop區(qū)。qPCR結果顯 示，野 生型ρ+A549細胞中可以檢測到mtDNA的拷貝數(shù)，經(jīng)低劑量EB連續(xù)誘導35 d的ρ0A549細胞中已無mtDNA的存在（圖2）。

2.3 Western印跡檢測結果

圖1 倒置顯微鏡下觀察A549和ρ0 A549細胞的形態(tài)

Western印跡結果顯示，野生型ρ+A549細胞中能表達核基因編碼的線粒體蛋白SDHA和ATP5A，同時也能表達線粒體基因組編碼的蛋白MT-COXI和MT-ATP6；ρ0A549細胞中無線粒體基因組編碼的蛋白MT-COXI和MT-ATP6的表達，但核基因編碼的SDHA和ATP5A蛋白均能夠正常表達（圖3）。

2.4 細胞生長曲線

在RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)野生型ρ+A549細胞，在含有尿嘧啶和丙酮酸的RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)ρ0A549細胞，MTT法檢測2組細胞的增殖力并繪制生長曲線。結果表明，與野生型ρ+A549細胞相比，ρ0A549細胞在24、48、72、96、120 h各時間點的生長速度均明顯減慢，2組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

人類mtDNA為雙鏈閉環(huán)DNA分子，長16 569 bp，一個細胞內常含有多個拷貝的mtDNA分子，且野生型和突變型往往同時存在[8]。mtDNA含有37個基因，分別編碼13個呼吸鏈多肽、22個tRNA和2個rRNA，此外有1個含基因復制和轉錄調控序列的非編碼區(qū)D-loop[8]。mtDNA與細胞癌變、腫瘤發(fā)生之間的關系已成為人類癌癥研究的熱點之一。目前，在許多不同類型的實體瘤中均發(fā)現(xiàn)了mtDNA拷貝數(shù)發(fā)生改變的現(xiàn)象[9]，而且mtDNA拷貝數(shù)的改變還與臨床病理參數(shù)和腫瘤的侵襲性有關[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在人肺腺癌A549細胞中，由于mtDNA拷貝數(shù)的減少而誘導的線粒體壓力引起了細胞表型的改變，顯著影響了腫瘤的增長和腫瘤的侵襲性，并且ρ0A549細胞較ρ+A549細胞的放射敏感性降低[11]。這些結果提示，mtDNA拷貝數(shù)的減少與線粒體氧化磷酸化復合物的下降密切相關，進而導致腫瘤細胞出現(xiàn)異常的能量代謝與物質代謝。

圖2 qPCR檢測A549和ρ0 A549細胞mtDNA拷貝數(shù)

圖3 Western印跡檢測ρ0 A549細胞核編碼蛋白質和線粒體編碼蛋白質

圖4 MTT檢測ρ0 A549細胞生長曲線（*P＜0.05）

已有研究表明，用低劑量EB處理腫瘤細胞可建立無mtDNA的腫瘤細胞系[12]。因為EB是一種DNA分子螯合劑，可以插入無組蛋白保護的mtDNA分子堿基內部，并顯著抑制DNA聚合酶γ在mtDNA復制過程中的活性[13]。細胞培養(yǎng)基中低劑量的EB即可導致人類細胞內的mtDNA分子完全缺失，導致細胞內存在線粒體但無mtDNA。mtDNA的缺失使線粒體基因組編碼的呼吸鏈必需的蛋白質缺失而導致呼吸鏈功能受損，細胞只能通過ATP/ADP轉位酶、糖酵解途徑產(chǎn)生的能量來維持生長需要。同時，由于線粒體電子鏈完整性受到破壞，波及到參與嘧啶合成的二氫乳氫酸脫氫酶活性，影響嘧啶核苷酸的生物合成，因而加入外源性的尿嘧啶核苷是無mtDNA的人類細胞系生長所必需的[14]。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)，以100 ng/mL EB誘導培養(yǎng)人肺腺癌A549細胞，能夠進行性降低細胞mtDNA拷貝數(shù)。研究中還發(fā)現(xiàn)，如果誘導7 d后撤除EB，mtDNA拷貝數(shù)會逐漸恢復。用EB連續(xù)誘導培養(yǎng)35 d的ρ0A549細胞則能逐漸形成較低水平的mtDNA拷貝數(shù)直到mtDNA完全缺失。這些結果強烈提示，EB誘導的人肺腺癌A549細胞內mtDNA缺失是一個長期積累的過程。PCR法是鑒定mtDNA缺失的常規(guī)方法之一，本研究通過qPCR檢測mtDNA擴增情況和mtDNA拷貝數(shù)，證實ρ0A549細胞中mtDNA的缺失。同時，Western印跡也表明，ρ0A549細胞不能表達線粒體基因組編碼的蛋白質，但是能夠正常表達核基因編碼的線粒體蛋白質。以上結果從分子水平上證實無mtDNA的ρ0A549細胞系已經(jīng)構建成功。MTT細胞增殖實驗結果表明，與野生型ρ+A549細胞相比，ρ0A549細胞在不同時間點的生長速度均明顯減慢，提示ρ0A549細胞已無法通過線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，而主要依靠糖酵解來供能維持細胞生長。

mtDNA突變與人肺腺癌發(fā)生關系密切[15-16]。由于ρ0A549細胞中缺乏內源mtDNA，可以通過細胞融合技術構建各種胞質雜交融合細胞（cy?brid），建立肺腺癌線粒體基因突變模型，并且有效排除核基因的干擾。在后續(xù)研究中，我們將進一步構建轉線粒體細胞系，研究相同核遺傳背景下，不同mtDNA分子的基因突變及功能變化，為人肺腺癌發(fā)生和mtDNA突變的相關性研究奠定基礎。

志謝：衷心感謝瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學院實驗醫(yī)學系周小山研究員、趙茜博士提供的實驗技術指導和對文稿寫作的建議。