黃夢(mèng)明，田鵬，劉占奇，李良，2，董孝元，2，*

（1.黃鶴樓酒業(yè)（咸寧）有限公司，湖北咸寧430007；2.武漢雅仕博科技有限公司，湖北武漢430050）

桂花（Osmanthus fragrans）系木犀科常綠灌木或小喬木，又名木犀、巖桂、九里香、金粟。原產(chǎn)于中國(guó)西南部，四川、云南、廣西、廣東和湖北等均是其產(chǎn)地[1]。桂花是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，在我國(guó)具有悠久的歷史[2]。

桂花不僅是具有高觀賞性的花卉植物，還是一種健康食品，富含大量的活性健康成分，其中黃酮類、多酚類等活性物質(zhì)在桂花中含量非常高。黃酮類物質(zhì)和多酚類物質(zhì)作為植物中存在的天然抗氧化劑，對(duì)人體內(nèi)各種自由基具有一定抑制作用[3-5]。

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和時(shí)代的變遷，飲酒的習(xí)慣也在逐漸改變，健康、個(gè)性化開始受到人們的關(guān)注。桂花酒作為一款露酒，可以很好的滿足現(xiàn)代人群的要求，具有很高的開發(fā)價(jià)值。市場(chǎng)上主流的桂花酒可分為兩種，一是以桂花為原料發(fā)酵釀造的桂花酒，二是以桂花為原料浸提生產(chǎn)的桂花酒，這兩種桂花酒各有特色，而通過(guò)現(xiàn)代技術(shù)分離純化桂花中生理活性成分生產(chǎn)出的新型桂花酒，是目前一種新的發(fā)展趨勢(shì)[6-11]。

本試驗(yàn)通過(guò)研究桂花酒的生產(chǎn)工藝中的浸提工藝，開發(fā)一種新型桂花酒，并且分析其活性成分，對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，為新型桂花酒的開發(fā)和發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮桂花：咸寧市桂花鎮(zhèn)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；無(wú)水乙醇、NaOH、Al（NO3）3、NaNO2、FeSO4、H2O2、水楊酸、鄰苯三酚（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；VC、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）、AB-8型大孔樹脂：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104E型電子分析天平：梅特勒-托利多（中國(guó)）有限公司；UV-2700分光光度計(jì)：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；HH-S型電熱恒溫水浴鍋：上海索普儀器有限公司；SF-TGL-16M臺(tái)式高速離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；KQ-250E超聲波清洗器：昆山舒美超聲儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Biosafer-18A（普通型）立式凍干機(jī)：賽飛（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桂花提取物的制備

桂花活性成分提?。喝∫押Y選好的新鮮桂花按照1∶4（g/mL）的比例加入70%乙醇，在60℃下振蕩提取2 h，過(guò)濾，取濾液在55℃下進(jìn)行減壓蒸餾，制得提取液。

桂花活性成分純化：取經(jīng)過(guò)前處理后裝柱好的AB-8型大孔樹脂按照1∶10（g/mL）提取液的比例上柱，徑高比控制在1∶15，上柱液流速控制在2 BV/h，上柱完畢后，用3 BV/h水進(jìn)行沖洗雜質(zhì)60 min，然后用70%乙醇按3 BV/h洗脫樹脂80 min，收集洗脫液，經(jīng)減壓蒸餾后，進(jìn)行冷凍干燥，得到桂花提取物的提取比率為20∶1。

1.3.2 新型桂花酒的生產(chǎn)工藝

3.5%桂花提取物→原酒浸提→過(guò)濾→澄清→過(guò)濾→桂花酒原酒→調(diào)配→灌裝→成品

1.3.3 感官評(píng)價(jià)

參照GB/T 27588-2011《露酒》中及GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對(duì)露酒的感官評(píng)價(jià)及綜合分析方法對(duì)樣品色澤、澄清度、香氣、滋味和風(fēng)格指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分[12-13]。確定具體分值并建立感官評(píng)價(jià)表，如表1所示，按照表1中所列各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)分。

表1 桂花酒感官評(píng)價(jià)表Table1 Osmanthus wine sensory evaluation form

1.3.4 桂花酒中黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2-Al（NO3）3法[14-15]進(jìn)行總黃酮的測(cè)定，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對(duì)桂花提取物中的原酒提取過(guò)程中的總黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出桂花提取物在浸提條件下的提取率。

1.3.5 新型桂花酒的浸提工藝單因素試驗(yàn)

以感官評(píng)價(jià)和總黃酮提取率評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)提取物浸提的酒精度、浸提溫度、浸提時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到最佳生產(chǎn)工藝。

1.3.5.1 桂花酒浸提酒精度的單因素試驗(yàn)

選擇酒精度為40%、50%、60%、70%vol的同種原酒對(duì)桂花提取物在75℃，提取2h，以桂花酒的感官評(píng)價(jià)得分及總黃酮的提取率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，得到最佳酒精度。

1.3.5.2 桂花酒浸提溫度的單因素試驗(yàn)

選擇酒精度為60%vol的同種原酒對(duì)桂花提取物在 55、65、75、85℃，提取 2 h，通過(guò)桂花酒的感官評(píng)價(jià)得分及總黃酮的提取率，得到最佳浸提溫度。

1.3.5.3 桂花酒浸提時(shí)間的單因素試驗(yàn)

選擇酒精度為60%vol的同種原酒對(duì)桂花提取物在75℃提取1、2、3、4 h，通過(guò)桂花酒的感官評(píng)價(jià)得分及總黃酮的提取率，得到最佳浸提時(shí)間。

1.3.6 新型桂花酒的浸提工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以浸提原酒的酒精度、浸提溫度、浸提時(shí)間為因素，采用三因素三水平做正交試驗(yàn)，以確定最佳浸提工藝條件。

1.3.7 桂花酒抗氧化試驗(yàn)

1.3.7.1 清除DPPH自由基

參考Jun的方法[16]，精確稱取12.5 mg DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成0.34 mmol/L的DPPH-乙醇溶液備用。精確量取125 mg/L的DPPH-乙醇溶液4 mL加入到加水稀釋后質(zhì)量濃度為20 mg/L～100 mg/L（以黃酮質(zhì)量濃度計(jì)）的桂花酒溶液8.0 mL中。搖勻后于避光處?kù)o置30 min進(jìn)行反應(yīng)，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1。以蒸餾水作為空白對(duì)照A0。以等質(zhì)量濃度的加水稀釋的桂花提取液，BHT和VC為對(duì)照。DPPH自由基清除率公式：

1.3.7.2 清除羥基自由基

參考文獻(xiàn)中的方法[17-18]，取加水稀釋后質(zhì)量濃度為20 mg/L～100 mg/L（以黃酮質(zhì)量濃度計(jì)）的桂花酒成品溶液10 mL添加到比色管中，依次添加2 mL 6 mmol/L水楊酸，2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液，2 mL 6 mmol/L H2O2溶液，搖勻，37℃下保溫30 min，在8 000 r/min下離心10 min，取上清液在510 nm處檢測(cè)吸光度值A(chǔ)X。將樣品用去離子水代替檢測(cè)吸光度值為A0，將雙氧水用去離子水代替檢測(cè)吸光度值為A1。取稀釋后的桂花提取液，BHT和VC等質(zhì)量濃度加入作為對(duì)照。羥基自由基清除率計(jì)算公式：

1.3.7.3 清除超氧陰離子自由基

參照文獻(xiàn)的試驗(yàn)方法[19-20]，將0.1 mol/L pH 8.2 Tris-HCl溶液和6 mmol/L鄰苯三酚在25℃下水浴保溫10 min，之后取5.7 mL pH 8.2 Tris-HCl溶液于比色管中，向比色管添加用水稀釋后質(zhì)量濃度為50 mg/L～200 mg/L（以黃酮質(zhì)量濃度計(jì)）的桂花酒成品溶液0.20 mL，最后加入0.1 mL 6 mmol/L鄰苯三酚，迅速搖勻，立即在325nm下測(cè)定其吸光度變化的動(dòng)態(tài)曲線，測(cè)定時(shí)間為5min，通過(guò)動(dòng)態(tài)曲線得到其自氧化速率為V1。以0.20 mL去離子水代替樣品作為空白對(duì)照，測(cè)定其自氧化速率為V0，空白自氧化速率控制在60 mAbs/min左右為宜。以等質(zhì)量濃度的BHT和VC加入作為對(duì)照。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Origin 2018和SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。所有樣品均平行測(cè)定3次，測(cè)定結(jié)果以x±sd表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 桂花酒浸提工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 桂花酒浸提酒精度的單因素試驗(yàn)結(jié)果不同酒精度對(duì)桂花酒的影響結(jié)果見圖1。

圖1 不同酒精度對(duì)桂花酒的影響Fig.1 The influence of different wine base’s alcohol degrees on osmanthus wine

由圖1可知，桂花總黃酮提取率基本隨著酒精度提高而增加，但是酒精度在70%vol時(shí)，桂花酒的感官評(píng)價(jià)由于較高的酒精度導(dǎo)致下降。因此在其他條件相同下，選擇加入酒精度為60%vol的原酒浸提具有較高的黃酮提取率和感官評(píng)價(jià)得分。

2.1.2 桂花酒浸提溫度的單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同浸提溫度對(duì)桂花酒的影響如圖2所示。

圖2 不同浸提溫度對(duì)桂花酒的影響Fig.2 Effects of different extraction temperature on osmanthus wine

由圖2可知，桂花總黃酮的提取率和桂花酒的感官評(píng)價(jià)基本隨著浸提溫度的升高而升高，但在75℃～85℃下提升幅度明顯減緩。因此在其他條件相同的情況下，75℃和85℃條件下感官評(píng)價(jià)得分相同，而85℃條件下，黃酮提取率略高于75℃，但從經(jīng)濟(jì)條件下考慮，選擇75℃浸提可能更符合生產(chǎn)需求。

2.1.3 桂花酒浸提時(shí)間的單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同浸提時(shí)間對(duì)桂花酒的影響如圖3所示。

圖3 不同浸提時(shí)間對(duì)桂花酒的影響Fig.3 Effects of different extraction time on osmanthus wine

由圖3可知，桂花總黃酮的提取率在2 h之后明顯減緩，說(shuō)明桂花總黃酮的提取在2 h基本完成，并且桂花酒的感官評(píng)價(jià)在2 h之后，也無(wú)太大變化。因此在其他條件相同的情況下，在2 h后感官評(píng)價(jià)得分基本不變，而黃酮提取率略微上升的情況下，綜合經(jīng)濟(jì)因素，選擇2 h浸提更加符合生產(chǎn)需求。

2.2 桂花酒的浸提工藝的正交試驗(yàn)分析

2.2.1 正交試驗(yàn)水平因素的確定

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)分析，選取酒精度中40%、50%、60%vol，浸提溫度 65、75、85℃，浸提時(shí)間 1、2、3h，以黃酮提取率及桂花酒成品感官評(píng)價(jià)為變量，進(jìn)行三水平三因素的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)表如表2所示。

表2 桂花酒浸提工藝正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Osmanthus wine extraction process orthogonal test factor level table

2.2.2 浸提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

桂花酒浸提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，桂花酒的浸提工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表4，方差分析見表5。

由表4可知，影響桂花酒原酒浸提工藝的黃酮提取率的主次因素依次為：C＞B＞A，即浸提時(shí)間＞浸提溫度＞酒精度；影響桂花酒原酒浸提工藝的感官評(píng)價(jià)的主次因素依次為：C＞B＞A，即浸提時(shí)間＞浸提溫度＞酒精度。由表5可知，浸提時(shí)間對(duì)桂花酒原酒的總黃酮提取率有極顯著影響，浸提溫度和酒精度對(duì)黃酮提取率有顯著影響，3個(gè)因素對(duì)桂花酒的感官評(píng)價(jià)沒有較大影響。綜合表4及表5，選擇原酒酒精度為60%vol，浸提溫度為85℃，浸提時(shí)間2 h。根據(jù)表4中浸提溫度對(duì)于提取率及感官評(píng)價(jià)的k2值與k3值的比較，及對(duì)經(jīng)濟(jì)效率的考慮，選擇在75℃條件下浸提更加合適。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，在酒精度為60%vol，浸提溫度為75℃，浸提時(shí)間2 h時(shí)，其提取率在93.21%，感官得分在94.9分，而原酒酒精度為60%vol，浸提溫度為85℃，浸提時(shí)間2 h的提取率95.33%，感官得分在96.1分，相比之下提高水平并不多，因此選擇前者更符合生產(chǎn)需求，即原酒酒精度為60%vol，浸提溫度為75℃，浸提時(shí)間2 h。

表3 桂花酒浸提工藝正交試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The orthogonal test scheme and test results of osmanthus wine extracting process

表4 桂花酒浸提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 4 Analysis of orthogonal test results of extraction process of osmanthus wine

表5 桂花酒浸提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Analysis ofvariance analysis of orthogonal test results of osmanthus wine extracting process

2.3 桂花酒抗氧化能力試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 桂花酒原酒及桂花酒成品酒的黃酮含量

桂花酒的黃酮含量見表6。

表6 桂花酒的黃酮含量Table 6 The flavonoids content of osmanthus wine

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)桂花提取液，桂花酒原酒及桂花酒成品酒，測(cè)定其總黃酮含量。從表6可知桂花中含有大量的總黃酮類物質(zhì)，經(jīng)提取后具有較高的純度和活性。提取物經(jīng)原酒溶解后，黃酮濃度具有較高水平，調(diào)配后的成品酒也有較高的黃酮含量。

2.3.2 桂花酒對(duì)DPPH自由基的清除能力

桂花酒對(duì)DPPH自由基清除能力試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 桂花酒對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH free radical scavenging capacity of osmanthus wine

DPPH自由基清除能力測(cè)試，是一種快速、簡(jiǎn)單的對(duì)自由基清除劑的篩選和判別方法。其原理是DPPH乙醇溶液呈紫色，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于自由基與自由基清除劑進(jìn)行單電子配對(duì)，紫色減褪，其褪色程度符合朗伯比爾定律[21]。

如圖4可知，4種物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除能力趨勢(shì)基本相同，都是隨著總黃酮的質(zhì)量濃度增加，對(duì)DPPH自由基的清除能力上升。通過(guò)計(jì)算4種物質(zhì)的 IC50值，VC的 IC50為 35.92 mg/L，BHT 的 IC50為60.49 mg/L，桂花提取液（質(zhì)量濃度以總黃酮質(zhì)量濃度計(jì)）的IC50為52.44 mg/L，桂花酒成品（質(zhì)量濃度以總黃酮質(zhì)量濃度計(jì)）的IC50為48.82 mg/L，因此對(duì)DPPH自由基的清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)閂C＞桂花酒成品＞桂花提取液＞BHT。

2.3.3 桂花酒對(duì)羥基自由基的清除能力

桂花酒對(duì)·OH清除能力試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 桂花酒對(duì)·OH清除能力Fig.5 The hydroxyl radical scavenging ability of osmanthus wine

·OH是一種活性氧自由基，具有極強(qiáng)的氧化性，并且能與抗氧化劑迅速反應(yīng)，在人體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)會(huì)產(chǎn)生少量的·OH，會(huì)對(duì)人體細(xì)胞造成損傷[22]。

從圖5分析可知：在質(zhì)量濃度均為20 mg/L～40 mg/L時(shí)，其他3種物質(zhì)對(duì)·OH清除能力均大于VC，其中桂花酒成品具有最強(qiáng)的清除效果；但在80 mg/L～100 mg/L質(zhì)量濃度下，VC比其他3種物質(zhì)的清除能力強(qiáng)；4種物質(zhì)對(duì)·OH的清除效果基本呈現(xiàn)出隨著質(zhì)量濃度的增加而遞增的趨勢(shì)，對(duì)4種物質(zhì)的IC50進(jìn)行計(jì)算，BHT的IC50值為51.25 mg/L，桂花提取液（質(zhì)量濃度以總黃酮質(zhì)量濃度計(jì)）的IC50值為48.02 mg/L，桂花酒成品（質(zhì)量濃度以總黃酮質(zhì)量濃度計(jì)）的IC50值為44.77 mg/L，VC的 IC50值為 51.64 mg/L，依照 IC50值來(lái)判斷，抗氧化能力強(qiáng)弱為：桂花酒成品＞桂花提取液＞BHT＞VC，但是在不同質(zhì)量濃度下每個(gè)物質(zhì)對(duì)·OH清除能力有所區(qū)別，并不是線性的。

2.3.4 桂花酒對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

桂花酒對(duì)O2-·清除能力見圖6。

圖6 桂花酒對(duì)O2－·清除能力Fig.6 Superoxide anion radical scavenging ability of osmanthus wine

O2-·是人體內(nèi)產(chǎn)生的一種活性自由基，正常情況下，會(huì)與人體內(nèi)細(xì)胞中如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，被除掉，達(dá)到機(jī)體內(nèi)的平衡。當(dāng)這種平衡失去時(shí)，O2-·會(huì)在人體內(nèi)積累，而機(jī)體的抗氧化酶類活性下降，此時(shí)O2-·會(huì)對(duì)人體的細(xì)胞造成損傷[23]。

根據(jù)圖6數(shù)據(jù)顯示：4種物質(zhì)對(duì)O2-·的清除能力基本隨著質(zhì)量濃度增大而增加，桂花提取液和桂花酒成品（質(zhì)量濃度以總黃酮質(zhì)量濃度計(jì)）遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于VC的清除能力，但比BHT的清除能力強(qiáng)。通過(guò)計(jì)算4種物質(zhì)的IC50值，得到VC的IC50值為79.39 mg/L，桂花酒成品的IC50值為123.91 mg/L，桂花提取液的IC50值為136.87 mg/L，BHT 的 IC50值為 168.83 mg/L，即對(duì) O2-·的清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)閂C＞桂花酒成品＞桂花提取液＞BHT。

3 結(jié)論

新型桂花酒采用植物功效成分提取技術(shù)，對(duì)桂花中的活性成分如黃酮等物質(zhì)進(jìn)行提取，得到具有較高純度的桂花提取物，然后加入原酒對(duì)桂花提取物進(jìn)行提取。本文主要針對(duì)桂花提取物的浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化，首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)對(duì)不同因素進(jìn)行分析，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交試驗(yàn)對(duì)浸提條件進(jìn)行優(yōu)選，綜合總黃酮提取率，桂花酒的感官評(píng)價(jià)及經(jīng)濟(jì)因素，選取酒精度為60%vol的原酒在75℃下浸提2 h，經(jīng)重復(fù)驗(yàn)證，具有較好的提取效果，且經(jīng)過(guò)調(diào)配后的桂花酒成品，具有優(yōu)良的感官特性，符合目前市場(chǎng)上對(duì)于健康的需求。

目前生產(chǎn)的新型桂花酒缺點(diǎn)在于經(jīng)過(guò)多次分離純化后，部分香氣成分物質(zhì)可能析出，因此如果能夠解決新型桂花酒的香氣損失問(wèn)題，就能夠生產(chǎn)出健康及風(fēng)味俱佳的桂花酒。針對(duì)新型桂花酒的研發(fā)工作，對(duì)桂花中活性物質(zhì)及香味成分物質(zhì)分析至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)有機(jī)構(gòu)或者公司對(duì)桂花香味物質(zhì)進(jìn)行研究，并且通過(guò)超臨界萃取、微波蒸餾萃取等技術(shù)進(jìn)行提取，制成桂花香氛[24-25]，因此針對(duì)新型桂花酒的香氣缺失問(wèn)題，如果向其中加入天然生產(chǎn)的桂花香氛，可能會(huì)解決此問(wèn)題，但其他影響尚且未知，需要通過(guò)之后的研究探討其效果。