謝 冰，陳 霞，于 駿，顏一丹，欒曉瑾，劉佳佳，喬 晨，方 杰

0 引 言

稽留流產(chǎn)指胚胎或胎兒死亡滯留宮腔內(nèi)未能自然排出，是自然流產(chǎn)的一種特殊類型，在我國(guó)發(fā)生率高達(dá)13.4%，但發(fā)病原因并為明確[1-2]。目前已證實(shí)細(xì)胞凋亡參與了稽留流產(chǎn)的發(fā)生，大量凋亡相關(guān)基因如Survivin、bax等均在稽留流產(chǎn)的組織中有不同程度的表達(dá)[3-4]。自噬和凋亡作為2種不同的程序性細(xì)胞死亡方式，共同調(diào)控著細(xì)胞的生長(zhǎng)與凋亡。目前研究表明，細(xì)胞自噬已經(jīng)成為了自身免疫性疾病、炎癥性疾病、癌癥、心血管疾病等多個(gè)全身性疾病的重要治療靶點(diǎn)[5]。自噬在稽留流產(chǎn)中的報(bào)道少見。Beclin-1及LC3均為自噬的重要標(biāo)志物，其中Beclin-1是形成自噬體的必須分子，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表示自噬水平的高低。本研究通過(guò)檢測(cè)稽留流產(chǎn)及正常妊娠患者絨毛及蛻膜組織中Beclin-1 mRNA及蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平，探討稽留流產(chǎn)與自噬的關(guān)系，為研究稽留流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，為其早期診斷及防治篩選新的靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1一般資料納入2017年1月至3月江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院婦科收治的30例稽留流產(chǎn)患者作為稽留組；同期收治的正常妊娠自愿流產(chǎn)患者30例作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕婦有明確生殖道及全身感染證據(jù)，既往有不良孕產(chǎn)史，自身免疫性疾病，孕期使用孕激素保胎治療?；艚M年齡(27.1±5.2)歲，對(duì)照組年齡(28.6±4.7)歲，兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；稽留組孕周為(8.7±0.9)周，對(duì)照組孕周(9.2±0.6)周，2組孕周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2標(biāo)本采集2組患者行清宮術(shù)后分別采集其絨毛及蛻膜組織共2份，均以等滲鹽水漂洗母體的血液。一份蛻膜及絨毛分別放入凍存管內(nèi)，0.5 h內(nèi)放入-80 ℃冰箱，待行熒光定量PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)；一份包埋成組織蠟塊，待日后行免疫組化染色。

1.3熒光定量PCR檢測(cè)絨毛及蛻膜組織中Beclin-1mRNA的表達(dá)分別取稽留組及對(duì)照組絨毛及蛻膜組織20 mg。Trizol法提取總RNA，檢測(cè)總RNA純度、濃度及完整性，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(GENEray，GK8030)說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后以cDNA 為模板，以無(wú)RNA酶的DEPC水作陰性對(duì)照，樣品及陰性對(duì)照均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃，預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，循環(huán)數(shù)40次，60 ℃退火延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，見表1。記錄擴(kuò)增曲線和熔解曲線,根據(jù)擴(kuò)增曲線，得到每個(gè)樣本的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表 1 引物序列及其產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.4WesternBlot檢測(cè)絨毛及蛻膜組織中Beclin-1及LC3蛋白的表達(dá)分別取稽留組及對(duì)照組的絨毛及蛻膜組織20 mg加入細(xì)胞裂解液4 ℃，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，離心半徑10 cm。30 μL上清，加入10 μL 4×SDS loading buffer，100 ℃加熱處理10 min。以12 000×g離心1 min，取上清上樣。樣品使用12% SDS-PAGE分離，每孔上樣量為10 μL。使用垂直電泳槽進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，條件為80 V 30 min，120 V 70 min。電泳結(jié)束后，將PVDF膜在甲醇中浸濕，再使用Transfer Buffer浸泡凝膠、濾紙和在甲醇中潤(rùn)濕過(guò)的PVDF膜數(shù)分鐘后制備轉(zhuǎn)移。使用轉(zhuǎn)移電泳槽進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，條件為80 V、90 min。轉(zhuǎn)膜完畢后，用Blocking Buffer封閉轉(zhuǎn)印膜1 h，加入兔抗Beclin-1單克隆抗體(稀釋度1∶500,Thermo公司產(chǎn)品)，兔抗LC3單克隆抗體(稀釋度1∶500,Thermo公司產(chǎn)品)4度孵育過(guò)夜。用1×PBST洗滌3次，每次10 min，加入羊抗兔IgG二抗(稀釋度1∶10 000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，室溫孵育1 h。用1×PBST洗滌3次，每次10 min，用ECL底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，并使用Gel-Pro analyzer軟件進(jìn)行灰度分析定量。

1.5免疫組化SP法觀察絨毛及蛻膜組織中Beclin-1蛋白的定位分別取稽留組及對(duì)照組的絨毛及蛻膜組織石蠟切片，試驗(yàn)步驟按SP法試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)說(shuō)明書進(jìn)行。 兔抗Beclin-1單克隆抗體(Thermo公司產(chǎn)品)稀釋100倍使用。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。使用DAB顯色，蘇木精復(fù)染，經(jīng)梯度乙醇脫水后中性樹膠封固，顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié) 果

稽留組絨毛及蛻膜組織中的Beclin-1 mRNA、Beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2，圖1。

免疫組化SP法檢測(cè)結(jié)果顯示，在兩組絨毛組織的合體滋養(yǎng)層及細(xì)胞滋養(yǎng)層中均有Beclin-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，蛻膜組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)。與對(duì)照組相比，Beclin-1蛋白在稽留流產(chǎn)絨毛及蛻膜組織中的表達(dá)水平均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。見圖2。

表 2 各組患者絨毛及蛻膜組織中Beclin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

1：正常妊娠絨毛； 2：稽留流產(chǎn)絨毛； 3：正常妊娠蛻膜； 4：稽留流產(chǎn)蛻膜

a：稽留流產(chǎn)絨毛；b：正常妊娠絨毛；c：稽留流產(chǎn)蛻膜；d：正常妊娠蛻膜

3 討 論

在正常早期妊娠囊胚著床后，絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞侵入母體螺旋動(dòng)脈，形成“滋養(yǎng)細(xì)胞栓”，閉合了螺旋動(dòng)脈，限制母血流入，導(dǎo)致胎盤在低氧狀態(tài)中發(fā)育。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，低氧能通過(guò)調(diào)節(jié)雷帕霉素靶蛋白信號(hào)途徑而增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬。Barbara等[7]對(duì)正常早期妊娠孕婦胎盤內(nèi)的自噬指標(biāo)Beclin-1和LC3進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示Beclin-1和LC3廣泛分布于滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)，說(shuō)明在妊娠早期存在明顯的自噬。自噬對(duì)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有雙重作用：一方面，當(dāng)外界環(huán)境不利于細(xì)胞生存時(shí)，少量的自噬可以通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)及受損的細(xì)胞器提供能量來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，以保證細(xì)胞存活[8]；另一方面，細(xì)胞凋亡與自噬相互促進(jìn)，自噬水平過(guò)度增強(qiáng)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，即自噬性細(xì)胞死亡[9]。自噬過(guò)多或不足均能導(dǎo)致產(chǎn)科并發(fā)癥的發(fā)生。Gao等[10]研究發(fā)現(xiàn)自噬增多可引起滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降，從而導(dǎo)致胎盤淺著床，參與了子癇前期的發(fā)生。在炎癥引起早產(chǎn)的患者胎盤中，自噬的活性明顯降低[11]。

自噬是生物進(jìn)化中一個(gè)高度保守的過(guò)程，其形成可分為4個(gè)階段：①受mTOR負(fù)調(diào)控的自噬誘導(dǎo)階段；②ClassⅢPI3K復(fù)合物(Atg6-Atg14-Vps34-Vps15)與Beclin-1結(jié)合后誘發(fā)自噬體膜形成的起始階段；③由Atg8-PE和Atg12-Atg5-Atg16泛素樣蛋白系統(tǒng)參與的雙層膜自噬體形成階段；④自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體的成熟降解階段[12-13]。其中Beclin-1參與的自噬體起始階段最為關(guān)鍵[14]。Beclin-1是形成自噬體的必須分子，作為分子反應(yīng)平臺(tái)可介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位于自噬泡，并與多種蛋白反應(yīng)調(diào)控自噬體形成與成熟,因此Beclin-1升高標(biāo)志著自噬的開始。當(dāng)自噬形成時(shí)，LC3Ⅰ可以轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3Ⅱ，后者定位于自噬體膜上，因此LC3Ⅱ/Ⅰ可以表示自噬水平的高低[15]。本研究證實(shí)，與正常妊娠患者相比，稽留流產(chǎn)患者的絨毛及蛻膜組織中Beclin-1mRNA及蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均呈上調(diào)趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示了在稽留流產(chǎn)的組織中自噬水平增強(qiáng)。推測(cè)自噬導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的原因?yàn)椋孩龠^(guò)量的自噬直接導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡，即II型程序性細(xì)胞死亡[16]；②過(guò)量的自噬可通過(guò)自噬溶酶體途徑降解生存素等抗凋亡因子導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而發(fā)生稽留流產(chǎn)[17]。

稽留流產(chǎn)是一種廣泛存在而嚴(yán)重的臨床事件。隨著二胎政策的放開，生育概率增加，稽留流產(chǎn)的發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)，尋找稽留流產(chǎn)的發(fā)病原因并制定出防治策略就顯得尤為重要。目前關(guān)于稽留流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在凋亡、炎癥以及血管生成異常等方面[18]；自噬在稽留流產(chǎn)中的研究甚少。本研究證實(shí)，與正常妊娠患者相比,稽留流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜組織中的Beclin-1 mRNA及蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平均明顯增高，說(shuō)明稽留流產(chǎn)的發(fā)生與自噬活性增強(qiáng)有關(guān)。本研究為稽留流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制提供了理論依據(jù)，可考慮作為篩選稽留流產(chǎn)早期診斷的靶標(biāo)之一。自噬導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的分子機(jī)制目前尚未明確，還需進(jìn)一步深入研究。