劉美麗， 劉 丹， 成小麗， 邢瑞楠， 田孝祥, 閆承慧

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016

心肌纖維化是指心肌組織中細(xì)胞過度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)過度堆積的一種疾病[1-3]。心肌纖維化發(fā)生過程中，心肌成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，活化為心肌肌成纖維細(xì)胞。而這類細(xì)胞可過度增殖和大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)，包括膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶等，這些物質(zhì)在心肌中大量沉積造成心肌結(jié)構(gòu)改變，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)[4-8]。E3泛素連接酶c-CBL(casitas B-lineage lymphoma)為酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)性調(diào)控因子[9-14]。c-CBL在各個組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，其中，在心臟及免疫細(xì)胞中的表達(dá)量較高。有研究表明，c-CBL在心血管、炎癥反應(yīng)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的生物學(xué)作用[15-18]。然而，c-CBL對心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響尚不清楚。因此，本研究采用血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)刺激小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞，構(gòu)建心肌成纖維表型轉(zhuǎn)換模型，通過建立c-CBL低表達(dá)細(xì)胞，再給予Ang Ⅱ刺激，檢測c-CBL對小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞α-平滑肌肌動蛋白(α smooth muscle actin，αSMA)和膠原1(collagen 1)分泌的影響，旨在細(xì)胞水平明確c-CBL經(jīng)Ang Ⅱ刺激后，對小鼠心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 小鼠c-CBL基因的小干擾RNA(中國生工生物公司)，RNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑(美國Thermo公司)，RNA提取試劑盒(美國Promega公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TakaRa公司)，蛋白裂解液(美國Thermo公司)，抗c-CBL抗體(美國Santa公司)，αSMA抗體(美國Sigma公司)，collagen 1抗體(美國abcam公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞分離及培養(yǎng) 采用0.2%Ⅱ型膠原酶提取C57乳鼠原代心肌成纖維細(xì)胞。將C57乳鼠置于75%乙醇中消毒，在超凈臺中將C57乳鼠心臟分離后，PBS清洗4次后，將心臟剪成細(xì)小的組織塊。采用0.2%Ⅱ型膠原酶消化心臟組織塊，37℃消化1 h，用含抗生素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中和消化的組織塊，1 000 r/min離心5 min。用DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀，貼壁2 h后，更換培養(yǎng)基。48 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.2.2 Ang Ⅱ刺激 將小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞分為對照組(未刺激)與Ang Ⅱ刺激組。Ang Ⅱ刺激組為不同濃度(1 μM和10 μM)的Ang Ⅱ刺激24 h。當(dāng)小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞融合至70%～80%時，給予不同濃度的Ang Ⅱ(1 μM和10 μM)刺激細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞提取RNA和蛋白。

1.2.3 構(gòu)建低表達(dá)c-CBL細(xì)胞及Ang Ⅱ刺激 當(dāng)細(xì)胞融合至80%時，使用opti-MEM培養(yǎng)基和RNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑將c-CBL的小干擾RNA(si-CBL)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，對應(yīng)的小干擾RNA對照(si-control)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后6 h，換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h收集細(xì)胞備用。待確定轉(zhuǎn)染條件后，將細(xì)胞分為si-control組(小干擾RNA對照轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h)、si-CBL組(c-CBL小干擾RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h)、si-control+Ang Ⅱ組(小干擾RNA對照轉(zhuǎn)染24 h后給予Ang Ⅱ刺激24 h)、si-CBL+ Ang Ⅱ組(c-CBL小干擾RNA轉(zhuǎn)染24 h后給予Ang Ⅱ刺激24 h)，提取RNA和蛋白。

1.2.4 RNA提取及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對細(xì)胞總RNA(500 ng)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以獲取細(xì)胞cDNA。采用SYBR Green法對cDNA行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)來擴(kuò)增c-CBL基因、αSMA基因和collagen 1基因。

1.2.5 蛋白提取及Western blot檢測蛋白表達(dá) 根據(jù)細(xì)胞總量，加入適量的蛋白裂解液，冰上裂解30 min。4℃，13 000 r/min離心15 min，上清為細(xì)胞總蛋白。BCA法對蛋白進(jìn)行定量。應(yīng)用SDS-PAGE膠對40 μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行電泳。一抗采用抗c-CBL抗體和αSMA抗體；二抗使用HRP標(biāo)記的抗體。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.6 免疫熒光染色 將細(xì)胞加到含有細(xì)胞玻片的6孔板中，待細(xì)胞融合至80%時，進(jìn)行si-CBL及si-control轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染后24 h再給予Ang Ⅱ刺激24 h。將細(xì)胞玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次。應(yīng)用Triton X-100(0.5%)通透10 min，PBS洗3次。山羊血清封閉30 min，加入collagen 1的抗體，4℃孵育過夜。次日使用帶熒光標(biāo)記的二抗(1∶100)進(jìn)行室溫避光孵育2 h，DAPI染細(xì)胞核。熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 不同Ang Ⅱ刺激條件對小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞αSMA及c-CBL表達(dá)的影響 Ang Ⅱ刺激組αSMA基因mRNA和蛋白均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但αSMA在1 μM與10 μM濃度Ang Ⅱ刺激下的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換模型建立成功。Ang Ⅱ刺激組c-CBL基因mRNA和蛋白水平均明顯高于對照組(P<0.05);但c-CBL在1 μM與10 μM濃度Ang Ⅱ刺激下的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 不同Ang Ⅱ刺激條件下小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞αSMA和c-CBL的表達(dá)(a.熒光定量PCR檢測不同濃度Ang Ⅱ刺激細(xì)胞后αSMA和c-CBL基因mRNA表達(dá)；b～c. Western blot檢測不同濃度Ang Ⅱ刺激細(xì)胞后αSMA和c-CBL蛋白表達(dá))

2.2 建立低表達(dá)c-CBL的小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞模型 熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)， si-CBL組c-CBL基因mRNA表達(dá)顯著低于si-control組，是si-control組的0.35倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2a。這提示在基因水平si-CBL干擾效果較好。Western blot結(jié)果顯示，si-CBL組c-CBL蛋白較si-control組顯著降低，是 si-control組的0.32倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2b～2c。上述結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染小干擾RNA可成功建立低表達(dá)c-CBL的小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞模型。

圖2 建立低表達(dá)c-CBL的小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞模型(a.熒光定量PCR檢測si-CBL轉(zhuǎn)染細(xì)胞后c-CBL基因mRNA表達(dá)；b～c.Western blot檢測si-CBL轉(zhuǎn)染細(xì)胞后c-CBL蛋白表達(dá))

2.3 c-CBL對Ang Ⅱ刺激后小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞αSMA表達(dá)的影響 si-control組和si-CBL組αSMA基因mRNA和蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Ang Ⅱ刺激后，si-control+Ang Ⅱ組和si-CBL+Ang Ⅱ組αSMA基因mRNA和蛋白較si-control組和si-CBL組明顯增加，且si-CBL+Ang Ⅱ組αSMA基因mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯低于si-control+Ang Ⅱ組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果提示，低表達(dá)c-CBL能降低Ang Ⅱ刺激后αSMA表達(dá)。見圖3。

圖3 c-CBL對Ang Ⅱ刺激后小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞αSMA表達(dá)的影響(a.熒光定量PCR檢測各組aSMA基因mRNA表達(dá)；b～c.Western blot檢測各組aSMA蛋白表達(dá))

2.4 c-CBL對Ang Ⅱ刺激后小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞collagen 1表達(dá)的影響 si-control組和si-CBL組collagen 1基因mRNA比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而Ang Ⅱ刺激后，si-control+Ang Ⅱ組和si-CBL+Ang Ⅱ組collagen 1基因mRNA均較si-control組和si-CBL組明顯增加，且si-CBL+Ang Ⅱ組collagen 1基因mRNA水平明顯低于si-control+Ang Ⅱ組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 c-CBL對Ang Ⅱ刺激后小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞collagen 1表達(dá)的影響(a.熒光定量PCR檢測各組collagen 1基因mRNA表達(dá)；b.免疫熒光檢測各組collagen 1表達(dá)，綠色熒光為collagen 1表達(dá)，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核)

3 討論

心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換在心肌纖維化過程中發(fā)揮重要作用。在一些病理因素作用下(Ang Ⅱ和缺氧等)，心肌成纖維細(xì)胞被激活轉(zhuǎn)換成心肌肌成纖維細(xì)胞，這類細(xì)胞通過增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，進(jìn)而參與心肌的損傷與修復(fù)。心肌成纖維細(xì)胞過度增殖，過度分泌的膠原等物質(zhì)在心肌大量堆積，可造成心肌的不可逆損傷[19-20]。c-CBL在擴(kuò)張型心肌病患者心肌組織中的表達(dá)增加。c-CBL基因敲除的小鼠在心肌缺血再灌注損傷后心功能明顯改善，且其下游關(guān)鍵的調(diào)控因子EGFR和FAK基因在c-CBL敲除的小鼠中明顯下調(diào)。在心肌細(xì)胞中，通過抑制c-CBL或抑制c-CBL泛素化配體的活性可減輕H2O2對心肌細(xì)胞的損傷[18]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ刺激后，心肌成纖維細(xì)胞中αSMA基因mRNA和蛋白水平明顯增加，提示Ang Ⅱ可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換。在小鼠心肌成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換的過程中，c-CBL基因mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加，提示c-CBL在小鼠心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中可能發(fā)揮重要作用。在c-CBL低表達(dá)細(xì)胞模型中給予Ang Ⅱ刺激，以明確c-CBL對心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與si-control組相比較，si-CBL組細(xì)胞在未給予Ang Ⅱ刺激時，αSMA和collagen 1基因mRNA和蛋白均無明顯改變，說明在正常生理情況下，c-CBL對心肌成纖維表型轉(zhuǎn)換不產(chǎn)生影響。因此，在si-CBL細(xì)胞中給予Ang Ⅱ刺激后再檢測心肌成纖維細(xì)胞αSMA和collagen 1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，c-CBL低表達(dá)后可降低Ang Ⅱ刺激后αSMA和collagen 1的表達(dá)，提示c-CBL對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換具有重要的調(diào)控作用。本研究也存在一定的局限性。首先，雖然已證實c-CBL對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換具有重要的調(diào)控作用，但具體的機(jī)制尚不清楚。有研究表明，c-CBL通過泛素化相應(yīng)的配體發(fā)揮生物學(xué)作用，如c-CBL通過介導(dǎo)β-連環(huán)蛋白的降解參與結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和血管新生[21]。但c-CBL能否通過介導(dǎo)相應(yīng)的泛素化配體參與心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的調(diào)控還尚未清楚。miRNA是一類非編碼RNA分子，通過調(diào)控下游靶基因參與多種生物學(xué)效應(yīng)。有研究表明，miR124-3p可通過調(diào)控c-CBL參與乳腺癌細(xì)胞的生長、增殖和浸潤[22]。那么，c-CBL是否也受到miR124-3p或其他miRNAs的調(diào)控參與心肌成纖維細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)換尚不明確。今后，需要從miRNA和泛素化角度探討c-CBL對小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，Ang Ⅱ刺激后心肌成纖維細(xì)胞c-CBL表達(dá)明顯增加，低表達(dá)c-CBL可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。