文/蔡愛華 李啟平 陳麗娟 李靜沛 李偉華

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL）是一類小分子分泌型糖蛋白，是人脂質(zhì)運載蛋白家族中的一個新成員，由Kjeldsen 等在1993年研究發(fā)現(xiàn)而確定[1]。近年來，隨著人們對NGAL 進(jìn)行深入研究，通過大量動物試驗和臨床試驗證明NGAL 含量變化與腎臟疾病、心血管疾病、糖尿病、炎癥等都有著密切的聯(lián)系，特別是腎損傷領(lǐng)域，能迅速靈敏地反映腎損傷的程度及恢復(fù)過程，已成為一種新的早期急性腎損傷的敏感標(biāo)志物[2]，且有望成為評估心血管疾病、預(yù)測不良心血管事件的新型評價指標(biāo)[3]。因此穩(wěn)定、快速和簡便的NGAL 檢測方法在臨床診斷中至關(guān)重要，據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，NGAL 檢測方法主要有蛋白質(zhì)印跡法、聚合酶鏈反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法和免疫組化法等方法[2]，各種方法均有優(yōu)缺點，其中免疫組化法中的免疫比濁法是近年來出現(xiàn)的一種操作簡單、靈敏度高、無污染，能夠在全自動生化儀上實現(xiàn)大批量自動化檢測的方法，滿足臨床應(yīng)用。

依據(jù)《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》的要求[4]，本研究采用膠乳免疫比濁法測定NGAL含量，對中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白檢測試劑盒進(jìn)行了方法學(xué)評價和檢測性能驗證。采用NGAL 試劑盒和日立7180 全自動生化分析儀組成檢測系統(tǒng)用于臨床檢驗，對其精密度、線性、正確度、抗干擾能力進(jìn)行研究驗證，為臨床常規(guī)檢測提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

日立7180 全自動生化分析儀，Milli-Q 超純水機(jī)，梅特勒-托利多移液器。

1.2 試劑

實驗所需試劑材料由試劑廠家提供：中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白檢測試劑盒（膠乳免疫比濁法）（Lot：20180209、20180217），配套校準(zhǔn)品（Lot：20180209、20180217）；高值質(zhì)控品（Lot：20180209）、低值質(zhì)控品（Lot：20180209）；正確度回收試驗人源樣本和標(biāo)準(zhǔn)溶液樣本；干擾物質(zhì)為膽紅素、維生素C、乳糜微粒、肝素鈉。

2 方法

2.1 檢驗方法

2.1.1 檢測原理

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（NGAL）與膠乳顆粒包被的抗人NGAL 抗體結(jié)合，發(fā)生凝聚反應(yīng)產(chǎn)生濁度，其濁度與樣本中的NGAL 含量成正比，因此可以用濁度來計算樣本中NGAL的濃度。

2.1.2 實驗條件

兩點終點法（+），主波長546nm，反應(yīng)溫度37 ℃，比色杯光徑1cm，R1 160μl，樣本量3μl，混勻，孵育5min，加R2 40μl，混勻，反應(yīng)20～30s 后 讀取吸光度A1，4min 后讀取吸光度A2，計算吸光度變化值，并根據(jù)吸光度變化值計算得出樣本中NGAL 的濃度。

2.1.3 校準(zhǔn)程序

采用廠家試劑盒配套校準(zhǔn)品多點校準(zhǔn)，采用非線性法校準(zhǔn)處理。

2.1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0 統(tǒng)計分析軟件、Excel 2010 進(jìn)行處理分析。評價線性和相關(guān)性是采用相關(guān)與回歸分析。

2.2 精密度試驗

依據(jù)CLSIEP5-A2[5]的文件要求，在室內(nèi)質(zhì)控，保證重復(fù)性條件下，分別以質(zhì)控高值（283ng/ml）和質(zhì)控低值（10ng/ml）為樣本，測定2 個不同批號試劑盒，每個批號測試2 次，連續(xù)測試20日，計算2 個濃度質(zhì)控品的重復(fù)性估計值和實驗室內(nèi)不精密度。

2.3 正確度回收試驗

選擇低濃度的人源樣本，重復(fù)測定3 次，計算平均值；在人源樣本中加入標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液（人源樣本與標(biāo)準(zhǔn)溶液樣本體積比為9：1），重復(fù)測定3 次，計算回收率。

表1 精密度試驗結(jié)果

2.4 線性試驗

用接近線性范圍下限的低值樣本（10ng/ml）稀釋接近線性范圍上限的高值樣本（3500ng/ml），混合成6 個稀釋濃度，范圍在10～3500ng/ml 間。分別測試以上樣本，每個樣本重復(fù)測定3 次，求出每個稀釋濃度測定結(jié)果的均值。以理論值為自變量，以實測均值為因變量求出線性回歸方程，計算線性回歸的相關(guān)系數(shù)（r）。

2.5 干擾試驗

參考CLSI EP7-A2[6]文件要求進(jìn)行抗干擾試驗驗證，將血清與一定量干擾物（膽紅素、維生素C、乳糜微粒以及肝素鈉）充分混勻，對照樣本中加入等體積的生理鹽水，分別測定3 次，計算平均值，并與預(yù)期值進(jìn)行比對，以干擾程度10%作為最高限，膽紅素系列干擾濃度為200、150、100、50μmol/L，維生素C 系列干擾濃度為0.5、0.4、0.3、0.2g/L，乳糜微粒系列干擾濃度為0.5%、0.4%、0.3%、0.2%，肝素鈉系列干擾濃度為50、40、30、20IU/ml。

3 結(jié)果

3.1 精密度試驗

精密度試驗結(jié)果如表1所示，所得重復(fù)性估計值和變異系數(shù)值均低于廠家規(guī)定的不精密度，符合要求。

3.2 正確度回收試驗

正確度回收試驗結(jié)果如表2所示，所得回收率為96.01%，滿足廠家規(guī)定的85%～115%間，符合要求。

3.3 線性評估結(jié)果

以理論值為X 軸，以實測均值為Y 軸，求出線性回歸方程為y=1.0798x+11.7399，相關(guān)系數(shù)（r）=0.9996。結(jié)果表明，此法測定NGAL 在10～3500ng/ml 范圍內(nèi)線性良好。

3.4 干擾試驗結(jié)果

加入干擾物與沒有加入干擾物的樣本結(jié)果比對顯示：膽紅素≤200μmol/L，維生素C ≤0.5g/L，乳糜微?！?.5%， 肝素鈉≤50IU/ml 時，對于測定NGAL無影響，符合標(biāo)準(zhǔn)要求，滿足臨床需求。

4 討論

NGAL 作為一種新型的分泌蛋白，與腎臟存在著密切的關(guān)系[7]，其水平的升高主要是由于腎臟受到損傷刺激時腎小管大量分泌NGAL，因此，NGAL 含量的改變直接反映了腎臟的損傷程度[8]，且先于肌酐、半胱氨酸蛋白抑制劑等其他腎損傷標(biāo)志物發(fā)生變化，是最具有應(yīng)用前景的早期腎損傷標(biāo)志物[9]。

近幾年，隨著新技術(shù)、新方法的不斷應(yīng)用，傳統(tǒng)方法已經(jīng)不能滿足臨床快速有效的檢測要求，所以一些新的檢測方法不斷更新，大部分方法具有一定局限性，存在操作繁瑣、檢測靈敏度低、測定線性范圍較小、只能單一檢測尿液或者血漿、檢測成本較高且需要特定儀器等不同問題[2]。本研究采用膠乳免疫比濁法在全自動生化分析儀上檢測，可以同時測定血樣和尿樣，檢測時間只需10min，且能滿足臨床實驗室快速、大批量自動化檢測的要求。通過方法學(xué)驗證，本法在全自動生化儀上檢測NGAL 含量有如下特點：①方法穩(wěn)定，②重復(fù)性良好，③線性范圍寬且具有良好線性，④正確度回收率高，⑤抗干擾性能良好，能較好地滿足臨床要求。

表2 正確度回收試驗結(jié)果

綜上所述，本文采用免疫比濁法在日立7180 全自動生化分析儀上對NGAL 進(jìn)行檢測，正確度、可重復(fù)性及穩(wěn)定性好，操作簡單全自動，檢驗快速，此法在臨床上檢測NGAL 濃度準(zhǔn)確高效。目前 NGAL 檢測也尚未有統(tǒng)一的檢測方法，本文對NGAL 檢測試劑盒（膠乳免疫比濁法）與日立7180 型全自動生化分析儀組成的檢測系統(tǒng)進(jìn)行驗證，為各實驗室選擇適合于本實驗室的最佳檢測方法提供更準(zhǔn)確的依據(jù)，以更好地應(yīng)用于臨床。