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        超聲輔助處理對乳清分離蛋白糖基化產(chǎn)物的理化特性影響

        2019-02-15 09:30:40李宛蓉秦新光
        中國糧油學(xué)報 2019年1期
        關(guān)鍵詞:乳清糖基化共聚物

        王 麒 李宛蓉 秦新光 劉 剛

        (武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,武漢 430023)

        美拉德反應(yīng)是糖分子與蛋白質(zhì)分子上的氨基通過共價鍵結(jié)合形成糖基化蛋白的化學(xué)反應(yīng)[6],而糖基化改性后的蛋白熱穩(wěn)定性、乳化性等物化性質(zhì)均明顯提高。目前,美拉德反應(yīng)主要通過濕法和干法兩種方式進行,而且兩種方法所得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物性質(zhì)均優(yōu)于原蛋白。研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白-葡聚糖糖基化產(chǎn)物的乳化性明顯增強[7]。杜研學(xué)等[8]利用干法美拉德反應(yīng),對從米渣中提取的谷蛋白進行糖基化改性,其所得的糖基化改性產(chǎn)物表面疏水性顯著降低,功能性質(zhì)在廣泛pH值范圍內(nèi)顯著提高。

        超聲技術(shù)在食品工業(yè)的應(yīng)用十分廣泛[9-10],由于超聲輔助生產(chǎn)具有提高生產(chǎn)率、縮短加工時間、操作簡單、節(jié)約成本等優(yōu)點,近年來受到從業(yè)者的青睞[11]。超聲輔助技術(shù)也在美拉德反應(yīng)中得到應(yīng)用,Li等[12]研究了超聲處理對花生分離蛋白-葡甘露聚糖共聚物的物化性質(zhì)影響,其結(jié)果表明超聲處理花生分離蛋白與葡甘露聚糖,促進了糖基化反應(yīng)的進行,其糖基化產(chǎn)物的物化性質(zhì)明顯提高。

        本試驗采用超聲輔助與水浴加熱兩種方式促進乳清蛋白糖基化反應(yīng),制備乳清分離蛋白與葡萄糖共聚物,并比較兩種處理方式制備的糖基化產(chǎn)物在游離氨基以及理化性質(zhì)等方面的差異,以此探討超聲輔助羰基化反應(yīng)的機理。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        一級大豆油;乳清分離蛋白(蛋白質(zhì)量分數(shù)96.88%);葡萄糖(分析純);其他試劑均為分析純:國藥集團化學(xué)分析有限公司。

        1.2 儀器

        T-18型高速分散儀;超聲儀(探頭為Φ 6mm) FS-系列超聲波處理器;Malvern200型激光粒度分析儀;高壓循環(huán)均質(zhì)機;TU-1800紫外可見分光光度計。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品制備

        稱取等量的乳清分離蛋白(WPI)和葡萄糖(glucose ,G)溶于0.2 mol/L pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液中,配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL 乳清分離蛋白、葡萄糖混合溶液,攪拌1 h并預(yù)熱至一定溫度。分別取幾份混合溶液在最佳超聲條件下(超聲溫度70 ℃,超聲功率300 W,預(yù)實驗測得)進行不同超聲時間(5、10、15、20、30、40、60 min)處理。將所得溶液進行冷凍干燥,凍干后的粉末4 ℃下保存。另取等量的混合溶液在水浴鍋中進行70 ℃處理,加熱時間分別為3、6、9、12、24、28、32 h。后續(xù)處理步驟與超聲處理組相同。

        對于政府而言,水權(quán)初始分配除了需要考慮諸多因素以確保分配結(jié)構(gòu)合理外,還需要確保分配規(guī)則滿足時代發(fā)展需要。從歷史發(fā)展來看,水權(quán)合理分配規(guī)則呈現(xiàn)動態(tài)發(fā)展之勢,它是時間和空間的產(chǎn)物,會隨時空的變化而變遷。影響水權(quán)合理分配規(guī)則變化的因素主要有兩個:一是自然環(huán)境的變化;二是社會環(huán)境變化。

        1.3.2 游離氨基測定

        采用鄰苯二甲醛(OPA)法[13]測定游離氨基含量從而計算WPI接枝度。取40 mg OPA溶于1 mL甲醇中,加入0.1 mol/L 25 mL硼砂溶液、體積分數(shù)為20% 2.5 mL十二烷基磺酸鈉溶液、100 μL β-巰基乙醇,并用去離子水定容至50 mL,即得OPA試劑。準確稱取超聲、水浴處理時間分別為0、20、40、60 min的蛋白樣品,將其配制成0.5 mg/mL的溶液,取樣品溶液400 μL,加入8 mLOPA試劑,混合均勻后置于35 ℃水浴2 min,取反應(yīng)后的溶液在340 nm下測定吸光值。并以賴氨酸作標準曲線,計算樣品中游離氨基的含量,并計算接枝度,接枝度(DG)的計算公式:

        DG =(A0-At) /A0×100%

        式中:A0為未進行糖基化反應(yīng)WPI的游離氨基含量;At為糖基化反應(yīng)后WPI-G接枝物的游離氨基含量。

        1.3.3 溶解性測定

        分別準確稱取一定量的WPI、超聲處理40 min、水浴28 h處理的樣品,配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液,將溶液等體積分為6份,用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液將6份溶液的pH值依次調(diào)節(jié)為3、4、5、6、7、8,室溫下磁力攪拌10 min (攪拌過程中保持pH值穩(wěn)定) 后,在4 ℃下離心15 min (10 000 r/min),取上清液用酶標儀測定溶液在590 nm處的吸光度,以5 mg/mL BSA溶液作標準曲線,計算樣品中蛋白濃度。蛋白質(zhì)的溶解性表示為上清液蛋白濃度占相應(yīng)的總蛋白濃度的百分比 (A590/A總×100%)。

        1.3.4 乳化性測定

        參考Meng等[14]的方法,并略有改動,分別取超聲處理40 min、水浴28 h處理后的WPI-G共聚物樣品,用pH為7.0的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量分數(shù)為0.5%的溶液,取3 mL的蛋白溶液和1 mL大豆油采用高速均質(zhì)機在20 000 r/min室溫下均質(zhì)1 min,從試管底部取50 μL勻漿液,用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的SDS溶液稀釋100倍并用渦旋儀混合均勻,以SDS溶液為空白,用紫外分光光度計分別測定500 nm處的吸光值。放置10 min后同樣位置測定吸光值。乳化性系數(shù)EAI和乳化穩(wěn)定性系數(shù)ESI由公式計算:

        EAI=(2.303×2×n×A0)/(C×Φ×10 000)

        ESI=A0×Δt/(A0-A10)

        式中:n為稀釋倍數(shù);Φ為油相體積分數(shù)0.25;C為蛋白質(zhì)的濃度/g/mL;A0為均質(zhì)后樣品500 nm吸光度;A10為均質(zhì)10 min后的樣品在500 nm處的吸光度;Δt為10 min

        1.3.5 乳液制備及粒徑分析

        分別稱取WPI以及超聲處理40 min、水浴28 h處理后的WPI-G共聚物分別溶于pH為7.5的磷酸鹽緩沖體系中,配制成2%(m/V)的溶液,攪拌使其完全溶解,加入0.02%的疊氮鈉,抑制微生物的生長,以樣品溶液為水相。以油水比為1∶9的比例加入大豆油,置于高速均質(zhì)機中以20 000 r/min轉(zhuǎn)速進行高速分散,制備粗乳,再將粗乳液通過高壓均質(zhì)機均質(zhì)(均質(zhì)溫度4 ℃,均質(zhì)壓力30 MPa)得到乳液,并將乳液置于4 ℃冰箱保存。各取三種乳液10 μL,用蒸餾水稀釋100倍,置于Malvern 200型激光粒度分析儀中分析粒徑大小,20 d后,另取乳液10 μL,蒸餾水稀釋100倍,再次測量乳液粒徑大小變化。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 游離氨基含量分析

        測定兩種處理方式下蛋白溶液中的游離氨基含量,見表1,水浴加熱處理WPI的游離氨基含量無明顯變化,當WPI以超聲波法進行加熱時,游離氨基的質(zhì)量濃度從0.066 mg/mL增至0.076 mg/mL。表明超聲處理有助于WPI與葡萄糖聚合反應(yīng)時釋放出更多的游離氨基。這與Mu等[15]的結(jié)論相吻合,超聲處理過程中產(chǎn)生的泡沫空化效應(yīng)增加了坍塌氣泡周圍區(qū)域的局部溫度和壓力,導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展、水解,肽鍵被破壞,大量的氨基酸殘基暴露出來。

        表1 不同處理方式下WPI游離氨基含量

        注:其他標準偏差均<0.001。

        2.2 接枝度分析

        接枝度可由游離氨基含量計算,因此兩種處理方式下WPI和葡萄糖的接枝度結(jié)果如表2所示,同一接枝度下的超聲輔助處理下的糖基化反應(yīng)時間明顯低于水浴加熱時間,超聲輔助法處理WPI與葡萄糖接枝度達到44.61%只需30 min,而相比之下,通過傳統(tǒng)加熱法接枝度達到45.05%則需24 h。此外,無論是水浴加熱還是超聲波處理,共聚物的接枝度均呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。這與JIANG等[16]的研究相符,可能是由于在美拉德反應(yīng)初始階段,乳清分離蛋白結(jié)構(gòu)部分展開,乳清分離蛋白與葡萄糖受熱后逐步結(jié)合,接枝度逐漸提高;但過度加熱時,一方面使乳清分離蛋白中的部分賴氨酸被破壞,另一方面則造成乳清分離蛋白結(jié)構(gòu)的充分伸展,乳清分離蛋白分子之間的相互作用增強,導(dǎo)致蛋白凝聚、沉淀,不利于接枝反應(yīng)的進行,最終導(dǎo)致接枝度反而降低。因此本文選取超聲處理40 min、水浴處理28 h作為后續(xù)試驗的樣品處理條件,此時兩種處理條件得到的共聚物接枝度均為48%左右,表明美拉德反應(yīng)程度較為接近,作為后續(xù)實驗的樣品處理條件具有可比較性,以便進一步比較超聲與水浴兩種處理方式對反應(yīng)產(chǎn)物物化性質(zhì)的影響更為明顯。

        表2 水浴和超聲處理下WPI和葡萄糖的接枝度

        2.3 溶解性分析

        蛋白的溶解性與其他物化性質(zhì)具有相關(guān)性,因此我們對不同pH值下的WPI及兩種處理方式的WPI-G共聚物進行溶解性分析,結(jié)果如圖1所示,未經(jīng)處理的WPI在pH在5.0左右溶解度最低,這是由于WPI的pH在等電點(5.0)左右,此時蛋白凈電荷為零,由于電荷不對稱而產(chǎn)生靜電相互作用引起蛋白發(fā)生聚集。而改性后的WPI糖基化產(chǎn)物在pH 5.0處溶解度明顯提高,且超聲處理相比于水浴熱處理條件下的WPI-G共聚物溶解度更好。可能是由于超聲處理導(dǎo)致肽鍵斷裂,蛋白親水性氨基暴露提高了蛋白質(zhì)的溶解性。

        圖1 不同處理方式下WPI-G共聚物的溶解度

        2.4 乳化性分析

        WPI和WPI-G共聚物的乳化性和乳化穩(wěn)定性變化如圖2所示,隨著超聲處理時間的延長,WPI-G共聚物的乳化性逐漸增強,EAI值在超聲時間為40 min時達到峰值。而水浴加熱WPI-G糖基化產(chǎn)物的EAI值也明顯高于原WPI。超聲處理40 min的WPI-G糖基化產(chǎn)物EAI值由初始值20.67 m2/g增加至40.84 m2/g,增加了99%。與水浴處理的WPI糖基化產(chǎn)物相比EAI值增加了59%。這均表明,超聲輔助糖基化反應(yīng)有效地改善了乳清蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。而且,超聲輔助糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性指數(shù)隨超聲時間的延長而逐漸增加,在超聲時間為30 min時達到峰值76.85 min,而后逐漸降低,可能是由于超聲時間過長,溶液溫度升高,蛋白分子結(jié)構(gòu)被破壞,出現(xiàn)絮凝等現(xiàn)象,導(dǎo)致后期乳化穩(wěn)定性降低。

        注:0表示W(wǎng)PI-G共聚物水浴加熱28 h。圖2 WPI及WPI-G共聚物不同超聲處理時間下的EAI和ESI值

        2.5 粒徑分布

        兩種處理方式下制得的WPI共聚物乳液粒徑分布如圖3所示,結(jié)果表明兩種糖基化產(chǎn)物為基質(zhì)的乳液平均粒徑均明顯小于原WPI乳液,且超聲處理所得的糖基化產(chǎn)物乳液粒徑更小,平均粒徑為60 nm左右,水浴處理的WPI-G共聚物乳液平均粒徑為200 nm左右,原WPI乳液平均粒徑為300 nm左右。而且三種乳液于4 ℃冰箱中靜置20 d后,所測得的乳液平均粒徑均沒有明顯變化,超聲處理制得的WPI-G共聚物乳液平均粒徑仍小于100 nm。表明WPI及WPI-G共聚物乳液均具有良好的儲藏穩(wěn)定性。這可能是由于WPI及其共聚物作為乳化劑提高了乳液穩(wěn)定性[17],且超聲處理的WPI-G共聚物乳化性高于水浴處理的WPI-G共聚物,可能是由于超聲處理能量更加集中,使WPI與葡萄糖的接枝反應(yīng)進行的更加完全,從而使其處理后的共聚物乳化性能更好。

        圖3 不同處理方式下WPI和WPI-G共聚物乳液的的粒徑分布

        3 結(jié)論

        3.1 乳清分離蛋白和葡萄糖的最佳超聲處理溫度為70 ℃,功率為300 W,當超聲時間為40 min時,蛋白溶液中游離氨基濃度增加,且此時接枝度最佳為48.10%,美拉德反應(yīng)程度達到最佳,而水浴加熱處理達到相同的接枝度需耗時28 h。

        3.2 超聲輔助處理和水浴加熱處理的WPI-G共聚物在等電點附近的溶解性均明顯增強,溶解度由19.09%增大至47.95% 。在等pH條件下超聲處理的WPI-G共聚物的溶解性優(yōu)于水浴加熱處理。

        3.3 超聲輔助處理WPI- G共聚物的乳化性增強,其乳化性數(shù)由20.67 m2/g增至40.84 m2/g,增大了99%,而相對于水浴加熱法乳化系數(shù)25.3 m2/g增大了59%。

        3.4 超聲輔助處理所得的WPI-G共聚物乳液平均粒徑為60 nm,明顯小于水浴加熱處理的WPI-G乳液粒徑(200 nm),二者與未處理的WPI乳液(粒徑300 nm)相比,粒徑更小、更穩(wěn)定,儲藏穩(wěn)定性更好。

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