鄂曉，游慶霞，陳效，尹東鋒

(新疆軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊 830000)

基因治療是將外源性的功能性治療基因遞送至靶細(xì)胞，取代缺陷、突變的基因，或調(diào)節(jié)目的蛋白的表達(dá)的一種療法?；蛑委熃陙?lái)得到廣泛的關(guān)注，據(jù)統(tǒng)計(jì)超過(guò)1800個(gè)基因治療的臨床實(shí)驗(yàn)被批準(zhǔn)[1]?；蛑委煘榘┌Y、人獲得性免疫缺陷綜合征、遺傳性疾病的有效治療帶來(lái)希望[2-4]。如何安全有效地將治療基因?qū)氲侥康募?xì)胞或組織是基因治療的關(guān)鍵。基因載體分為病毒載體和非病毒載體兩類。病毒載體具有很高的轉(zhuǎn)染效率，由于安全性的原因，包括免疫原性、插入突變性等問(wèn)題，限制了病毒載體的臨床應(yīng)用[5]。非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率雖不及病毒載體，但具有易于制備、成本低、免疫毒性低等優(yōu)勢(shì)，2004—2013年，使用非病毒載體的臨床實(shí)驗(yàn)逐年增加，而使用病毒載體的卻顯著下降[6]。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)是最常用的非病毒載體之一，分子中含有高密度的胺基基團(tuán)，可產(chǎn)生“質(zhì)子海綿”作用，使PEI與DNA所形成的復(fù)合物從內(nèi)涵體中逃逸出來(lái)，進(jìn)入細(xì)胞核，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率。PEI的轉(zhuǎn)染與其相對(duì)分子質(zhì)量密切相關(guān)，隨著相對(duì)分子質(zhì)量的增加，其轉(zhuǎn)染效率也增高，但其細(xì)胞毒性也隨之增大，同時(shí)PEI/DNA復(fù)合物膠體穩(wěn)定性較差，易在體液環(huán)境中發(fā)生聚集，被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所清除，限制PEI的臨床應(yīng)用[7]。筆者在本研究使用泊洛沙姆188(poloxamer 188，P188)修飾高相對(duì)分子質(zhì)量PEI，P188是兩親性嵌段共聚物，平均相對(duì)分子質(zhì)量為8350，包含親水性的聚氧乙烯基團(tuán)和疏水性的聚氧丙烯基團(tuán)，毒性很低，作為乳化劑可靜脈使用，并顯著提高膠體的穩(wěn)定性。文獻(xiàn)[8]報(bào)道采用平均相對(duì)分子質(zhì)量為11 500的泊洛沙姆407，但P188相對(duì)分子質(zhì)量小，與細(xì)胞親和力好，轉(zhuǎn)染相率相對(duì)較高，因此將P188末端羥基活化后，化學(xué)聯(lián)接到PEI分子上，考察其作為基因載體的可行性。

1材料與儀器

1.1細(xì)胞 MCF-7細(xì)胞(批號(hào)：161110)、HeLa細(xì)胞(批號(hào)：170122)、HepG2細(xì)胞(批號(hào)：160611)均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。于含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle's medium，DMEM)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基置于37 ℃、相對(duì)濕度90%、5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中。

1.2藥品與試劑 泊洛沙姆188(P188，德國(guó)BASF公司，批號(hào)160323)；PEI(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：171023)；4-甲氧基氯化三苯甲烷(上海韶遠(yuǎn)科技有限公司，批號(hào)：R1411185)；三光氣(上海韶遠(yuǎn)科技有限公司，批號(hào)：R1502028)；N-羥基琥珀酰亞胺(上海韶遠(yuǎn)科技有限公司，批號(hào)：R1412263)；質(zhì)粒DNA(KD，批號(hào)：170912)；噻唑藍(lán)(MTT，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：170628)；DMEM(Thermo公司，批號(hào)：171011)、磷酸鹽緩沖液(Thermo公司，批號(hào)：170818)；胎牛血清(Gibco公司，批號(hào)：170526)；胰蛋白酶(Thermo公司，批號(hào)170628)；二甲亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：161223)；質(zhì)粒pGL3(美國(guó)Promega公司，批號(hào)：170306)。

1.3儀器與設(shè)備 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE2000B，上海亞榮生化儀器廠)；納米粒度電位儀(Zetasizer Nano ZS90，英國(guó)馬爾文公司)；CO2培養(yǎng)箱(BC-J80S，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；DNM-9602酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；磁共振波譜儀(型號(hào)：Mercury Plus 300MHz，美國(guó)Varian公司)；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(型號(hào)：GloMax 96，美國(guó)Promega公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(型號(hào)：Tanon 2500R，上海天能科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1方法

2.1.1PEI的修飾 P188約1 mmol(8.350 g)在50 ℃下真空干燥，溶解在無(wú)水吡啶40 mL中，加入4-甲氧基三苯基氯甲烷0.308 g(1 mmol)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)、25 ℃下磁力攪拌反應(yīng)4 h，反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后以二氯甲烷20 mL溶解，經(jīng)硅膠柱純化，蒸干洗脫液得到淡黃色產(chǎn)物(收率78.3%)。

將上述產(chǎn)品(4.310 g，約0.5 mmol)以甲苯-二氯甲烷(3：1)混合溶劑40 mL溶解，加入三光氣0.149 g(0.5 mmol)，25 ℃下磁力攪拌，反應(yīng)液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后以甲苯和二氯甲烷(2：1)的混合溶劑30 mL溶解，加入N-羥基琥珀酰亞胺0.060 g (0.5 mmol)和無(wú)水三乙胺0.071 mL(0.5 mmol)，磁力攪拌反應(yīng)4 h，反應(yīng)液濾過(guò)后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再以二氯甲烷10 mL溶解，經(jīng)過(guò)硅膠柱純化，得到產(chǎn)物(收率83.6%)。

將6份PEI 0.250 g(0.01 mmol)以10%乙醇溶液溶解，分別加入上述活化后的P188(0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 mmol)，25 ℃下磁力攪拌，脫去保護(hù)基團(tuán)，將反應(yīng)液pH值調(diào)至中性，采用葡聚糖凝膠色譜柱分離純化產(chǎn)物，再使用超濾管(MWCO=10000)進(jìn)一步純化，純化后的產(chǎn)物(收率52.7%)經(jīng)冷凍干燥后置于-20 ℃下備用。將純化后的最終產(chǎn)物溶解到D2O中，進(jìn)行1H-NMR分析。合成的新聚合物命名為(P188)1-PEI，(P188)2-PEI、(P188)5-PEI、(P188)10-PEI、(P188)20-PEI，其中下標(biāo)數(shù)字1，2，5，10，20代表該聚合物中每個(gè)PEI聯(lián)接的P188的數(shù)目。

2.1.2凝膠電泳分析 取適量質(zhì)粒DNA和PEI以及(P188)n-PEI分別以5%葡萄糖溶液(pH值7.5)溶解，配制成適當(dāng)濃度，將聚合物溶液逐滴加入到等體積DNA溶液中，室溫孵育20 min，制成不同N/P值的復(fù)合物。將上述制得復(fù)合物分別上樣，進(jìn)行電泳分析，電泳條件：1.0%瓊脂糖，1×TAE緩沖液，電壓100 V，電泳時(shí)間60 min。紫外透射儀觀察并攝像。

2.1.3復(fù)合物粒徑和Zeta電位測(cè)定 取上述制備的不同N/P值的復(fù)合物適量，加入超純水稀釋，使用納米粒度電位儀測(cè)定復(fù)合物的粒徑和Zeta電位。

2.1.4細(xì)胞毒性測(cè)定 分別將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、HepG2細(xì)胞以每孔1.2×105個(gè)的密度接種到96孔板中，加入DMEM，每孔 1 mL，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%。實(shí)驗(yàn)前，吸去培養(yǎng)基，每孔加入不同N/P值為3，6，12，24，48的復(fù)合物20 μL，孵育6 h后換含有10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，加入0.5 mg·mL-1MTT 100 μL，37 ℃孵育4 h。吸取上清液，加入DMSO200 μL，振蕩10 min，492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值(A)。以未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照(100%)。細(xì)胞相對(duì)活性的計(jì)算公式為：細(xì)胞活性 (%)=A實(shí)驗(yàn)/A對(duì)照×100%。

2.1.5體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染前一天用0.25%胰酶消化HeLa細(xì)胞，均勻接種在24孔板上，每孔加入DMEM 1 mL，培養(yǎng)24 h，使HeLa細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%。轉(zhuǎn)染前，換上無(wú)血清DMEM，加入新鮮配制的復(fù)合物100 μL，含pGL3-Control質(zhì)粒3 μg，每種復(fù)合物平行實(shí)驗(yàn)3次，輕輕搖動(dòng)24孔板使復(fù)合物鋪勻，孵育4 h后換含有10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，加冰浴的CCLR細(xì)胞裂解液100 μL覆蓋細(xì)胞，溫和振搖培養(yǎng)液15 min，收集裂解液，14 000 r·min-1離心5 min。取上清液5 μL，加入蟲熒光素測(cè)定液100 μL于化學(xué)發(fā)光測(cè)定小杯中，混勻，用蟲熒光素酶分析系統(tǒng)立即測(cè)定10 s內(nèi)蟲熒光素酶活性的計(jì)數(shù)，其中計(jì)數(shù)用相對(duì)光單位(relative light unit，RLU)表示。BCA法測(cè)定裂解液中細(xì)胞蛋白總量，以此校正由于每孔細(xì)胞之間密度不同而導(dǎo)致的蟲熒光素酶表達(dá)量的差異，最終以每毫克細(xì)胞蛋白的相對(duì)光單位來(lái)表示蟲熒光素酶的活性。

2.2結(jié)果

2.2.1聚乙烯亞胺的修飾 P188修飾PEI時(shí)，首先將P188一端羥基使用4-甲氧基三苯基氯甲烷保護(hù)，再將另一端未保護(hù)的羥基活化成琥伯酰亞胺碳酸酯，與PEI的胺基端聯(lián)接，再經(jīng)脫保護(hù)和凝膠色譜純化，得到新的陽(yáng)離子聚合物，反應(yīng)路線見(jiàn)圖1。新聚合物的典型1H-HMR譜見(jiàn)圖2。-CH2CH2O-的質(zhì)子峰在δ3.5～3.9 ppm，-CH2CH2NH-的質(zhì)子峰在δ2.8～3.5 ppm，-CH3的質(zhì)子峰在δ1.2～1.3 ppm。根據(jù)1H-NMR譜中-CH2CH2O-(P188)和-CH2CH2NH-(PEI)的質(zhì)子峰面積，計(jì)算新聚合物中兩者比例，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2凝膠電泳分析 帶有負(fù)電荷的DNA分子在電場(chǎng)作用和中性pH緩沖液條件下，可通過(guò)瓊脂糖凝膠從負(fù)極向正極泳動(dòng)，當(dāng)陽(yáng)離子聚合物與DNA分子通過(guò)電荷作用牢固結(jié)合后，可阻滯DNA分子在凝膠中的遷移。圖3為不同N/P值時(shí)復(fù)合物的凝膠電泳阻滯圖，隨著PEI修飾度的增加，即每個(gè)PEI分子聯(lián)接P188數(shù)目的增多，(P188)n-PEI與DNA完全結(jié)合的N/P值也隨之增大。PEI/DNA，(P188)1-PEI/DNA和 (P188)2-PEI/DNA復(fù)合物在N/P值為3時(shí)，聚合物即可以完全結(jié)合DNA。而(P188)5-PEI/DNA，(P188)10-PEI/DNA，(P188)20-PEI/DNA復(fù)合物分別在N/P值為6，8，18時(shí)，P188-PEI才可以完全結(jié)合DNA，阻止其在瓊脂糖凝膠中的遷移。

2.2.3復(fù)合物粒徑和Zeta電位 復(fù)合物的粒徑及Zeta電位測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2和表3。隨著復(fù)合物N/P值的增加，復(fù)合物的粒徑有減小的趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著PEI量的增加，對(duì)DNA的壓縮能力增強(qiáng)。高修飾度的(P188)n-PEI(n=5，10，20)所形成的復(fù)合物粒徑偏大，可能是因?yàn)閷?duì)DNA的壓縮能力有所下降所致。未經(jīng)修飾的PEI與DNA形成的復(fù)合物在N/P值為48時(shí)，可以觀察到明顯的聚集現(xiàn)象。復(fù)合物Zeta電位隨N/P值的增加而增加，這是因?yàn)殡S著PEI量的增加正電荷增加所致。相同N/P值復(fù)合物的Zeta電位隨著P188修飾量的增加而減小，這是由于P188遮蔽PEI的正電荷所致。

2.2.4細(xì)胞毒性 復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性與細(xì)胞株有一定的依賴性，對(duì)MCF-7細(xì)胞毒性最大，HeLa細(xì)胞次之，HepG2細(xì)胞最小。隨著N/P值增加，復(fù)合物對(duì)3種細(xì)胞的毒性也增加。(P188)n-PEI與PEI相比，在低N/P值時(shí)即可顯著降低對(duì)3種細(xì)胞的毒性；高N/P N/P值時(shí)，高修飾的(P188)n-PEI(n=5，10，20)可顯著地降低細(xì)胞毒性。隨著(P188)n-PEI相對(duì)分子質(zhì)量和親水性的增加，可以大大降低細(xì)胞毒性，特別是MCF-7細(xì)胞。P188對(duì)PEI的修飾可以顯著地降低其細(xì)胞毒性，這是因?yàn)槭褂帽砻婊钚詣㏄188對(duì)PEI修飾后可以屏蔽PEI表面的正電荷，可以降低細(xì)胞膜表面的電荷密度，避免細(xì)胞死亡。但是這種屏蔽作用會(huì)使復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的親合力下降，可能會(huì)引起轉(zhuǎn)染效率降低。見(jiàn)圖4。

圖1 反應(yīng)路線圖(n=1，2，5，10，20)

圖2 聚合物的1H-NMR譜

表1 聚合物的性質(zhì)

2.2.5體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)圖5，未經(jīng)修飾的PEI在N/P=6時(shí)其轉(zhuǎn)染效率最佳，隨著N/P值的提高(N/P≥6)，PEI的轉(zhuǎn)染效率逐漸降低，特別是N/P=48時(shí)，轉(zhuǎn)染效率只有最佳轉(zhuǎn)染效率的2.5%。而(P188)n-PEI在N/P=3值時(shí)，轉(zhuǎn)染效率顯著較低；在N/P=12和N/P=24時(shí)，可以保持較高的轉(zhuǎn)染效率，特別是(P188)1-PEI其最佳轉(zhuǎn)染效率(N/P=24時(shí))顯著高于PEI的最佳轉(zhuǎn)染效率(P<0.01)。特別是在高N/P值(N/P=48)時(shí)，(P188)n-PEI都顯現(xiàn)出較好轉(zhuǎn)染效率。

圖3PEI/DNA和(P188)n-PEI/DNA復(fù)合物不同N/P值時(shí)凝膠電泳圖

Fig.3GelelectrophoresisofPEI/DNAand(P188)n-PEI/DNAcompoundatvariousN/Pratio

表2 復(fù)合物在不同N/P值時(shí)的粒徑

Tab.2 Particle sizes of the compound of various N/P ratios

表2 復(fù)合物在不同N/P值時(shí)的粒徑

復(fù)合物N/P=6N/P=9N/P=12N/P=24N/P=48PEI164±31121±22106±16 268±41 8521±839(P188)1-PEI182±11190±22132±10 87±6 99±13(P188)2-PEI196±11214±12189±15 124±9 113±11(P188)5-PEI273±8240±13299±13 177±12 125±14(P188)10-PEI-314±15267±10 221±13 115±8(P188)20-PEI--- 277±18 185±12

“-”由于陰離子聚合物和DNA結(jié)合率低未檢測(cè)出

“-” not determined due to low binding of cationic polymer to DNA

表3 復(fù)合物在不同N/P值時(shí)Zeta電位

Tab.3 Zeta-potential of the compound at various N/P ratios

表3 復(fù)合物在不同N/P值時(shí)Zeta電位

復(fù)合物N/P=6N/P=9N/P=12N/P=24N/P=48PEI22.4±1.330.4±2.739.7±2.542.3±0.747.9±1.1(P188)1-PEI17.8±1.523.8±2.027.4±0.431.6±0.733.3±0.8(P188)2-PEI15.3±1.519.4±2.322.7±2.228.6±0.832.3±0.6(P188)5-PEI3.2±1.112.4±0.618.1±0.922.3±2.128.0±2.2(P188)10-PEI-4.6±1.77.4±1.215.3±2.117.2±1.623.5±1.3(P188)20-PEI-13.4±2.5-5.8±1.96.6±0.79.8±1.113.5±0.8

A.MCF-7細(xì)胞；B.HLa細(xì)胞；C.HepG2細(xì)胞

A： MCF-7 cells； B： HeLa cells； C： HepG2 cells

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)先將非離子表面活性劑P188的一端羥基保護(hù)，采用琥珀酰亞胺酯法將另一端羥基進(jìn)行活化，活化后的產(chǎn)物可以在溫和的條件下與PEI的氨基快速和充分地反應(yīng)，最后脫去保護(hù)基團(tuán)，得到新的聚合物(P188)n-PEI(n=1，2，5，10，20)，其在生理?xiàng)l件下比較穩(wěn)定，不易發(fā)生水解。

本實(shí)驗(yàn)制備的復(fù)合物的粒徑大多都在60～400 nm范圍內(nèi)，大部分文獻(xiàn)所報(bào)道用于體內(nèi)外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的復(fù)合物粒徑均在此范圍[9-10]。復(fù)合物Zeta電位隨著N/P值的增加而增加，這是因?yàn)殡S著陽(yáng)離子聚合物用量的增加，復(fù)合物所帶正電荷也相應(yīng)增加；在相同N/P值時(shí)，復(fù)合物Zeta電位隨著P188修飾量的增加而減小，這是因?yàn)檩^多的P188遮蔽PEI的正電荷。高的Zeta電位會(huì)造成較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，這是因?yàn)閺?fù)合物表面的正電荷聚集在細(xì)胞膜表面，引起細(xì)胞膜破裂。隨著N/P值的提高，復(fù)合物的細(xì)胞毒性隨之增加，PEI表現(xiàn)尤為明顯，而 (P188)n-PEI由于P188遮蔽了復(fù)合物的正電荷，其毒性顯著減小，特別是高修飾度的(P188)n-PEI(n=10或20)。

體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，PEI/DNA復(fù)合物在高N/P值(N/P=24，48)時(shí)，由于較高的細(xì)胞毒性，造成細(xì)胞的大量死亡，其轉(zhuǎn)染效率很低，而(P188)n-PEI /DNA復(fù)合物則在高N/P值時(shí)可以保持較高的轉(zhuǎn)染效率。對(duì)PEI的修飾，必須做好細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率之間的平衡，修飾物可以遮蔽PEI表面的正電荷，降低復(fù)合物的Zeta電位，減小細(xì)胞毒性，同時(shí)減少了復(fù)合物被細(xì)胞的攝取，降低了轉(zhuǎn)染效率[11-12]。本實(shí)驗(yàn)制備的(P188)1-PEI既降低了PEI細(xì)胞毒性又在高N/P值保持了很高的轉(zhuǎn)染效率，預(yù)期(P188)1-PEI可以攜帶更多量的基因進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染。