楊海光，趙贏，楊世穎，方蓮花，宋俊科，呂揚，杜冠華

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所1.藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室；2.晶型藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050)

芒果苷( mangiferin，1，3，6，7-tetrahydroxyxanthone-C2-β-D-glucoside)又稱知母寧、芒果素，主要從漆樹科和龍膽科植物的葉、莖、果實、樹皮中提取得到，也是中藥知母的主要活性成分。其結構由氧雜蒽酮的苷元和1個葡萄糖以糖苷鍵的形式相連而成，屬于多酚酸類化合物。近年來，國內(nèi)外大量研究報道芒果苷廣泛的藥理學活性，包括治療糖尿病及其并發(fā)癥[1]、調節(jié)脂代謝異常[2]、抗腫瘤[3]、心血管保護[4]、抗高尿酸血癥[5]、神經(jīng)保護[6]、抗氧化[7]、抗炎[8]、解熱和鎮(zhèn)痛[9]、抗菌、抗病毒[10]、抗輻射、保肝、促進骨骼發(fā)育、抗過敏和免疫調節(jié)等，具有進一步研究和開發(fā)的可能性。固體化學藥物的多晶型現(xiàn)象是一種普遍存在的自然現(xiàn)象，這種現(xiàn)象是指一種固體化學藥物可以存在≥2種不同固體物質存在狀態(tài)，又稱為“同質異晶”現(xiàn)象[11]。同一種藥物的不同晶型物質在溶解度、溶出速率、熔點、密度、硬度、外觀以及生物有效性等方面可能存在較大差異，從而影響藥物的穩(wěn)定性、生物利用度及療效的發(fā)揮[12]。為了確定芒果苷的優(yōu)勢藥物晶型，筆者在制備芒果苷3種晶型的基礎上，利用固體給藥的方法，采用大鼠進行體內(nèi)藥動學研究。報道如下。

1 實驗動物、儀器與試藥

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級SD大鼠，雄性，體質量200～220 g，購自北京華阜康生物技術股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(京)2014-0004。自由攝食飲水。

1.2儀器 d/max-2550粉末X射線衍射儀(日本Rigaku公司)，固體灌胃器(中國醫(yī)學科學院藥物研究所國家藥物篩選中心研制)，液相色譜-質譜聯(lián)用儀(Agilent 1200-6110 系列，G1379B 在線脫氣機，G1311A 四元梯度泵，G1329A 自動進樣器，G1315DDAD 檢測器及系統(tǒng)控制器，G1316A 柱溫箱，6110 單四級桿質譜儀，ESI 離子源，美國Agilent 公司)，臺式高速冷凍離心機(美國Beckman 公司，型號：AllegraTM X-22R)，漩渦混勻器(上海凡勁儀器設備有限公司，型號：Vortex-2)，氮吹儀(美國Organomation 公司)，微量移液器(德國Eppendorf 公司)。

1.3試藥 芒果苷晶Ⅱ型、晶Ⅴ型、晶Ⅵ型3種晶型(由中國醫(yī)學科學院藥物研究所藥物晶型中心提供)，頭孢呋辛鈉對照品(大連美侖生物技術有限公司)，甲酸(Fisher，質譜純)，甲醇、乙酸乙酯(北京化工試劑公司，分析純)。

2 方法與結果

2.1粉末X射線衍射 取樣品100 mg，研磨過孔徑0.150 mm(100目)篩，精密稱取50 mg，進行X射線粉末衍射實驗。檢測條件：CuKa輻射，石墨單色器，管壓40 kV，管流150 mA，2θ掃描范圍3°～80°，掃描速度8°·min-1，步長0.02°。狹縫條件：發(fā)散狹縫為1°，限高狹縫為10 mm，防散射狹縫為1°，接收狹縫為0.30 mm。粉末X射線衍射分析結果表明，3種晶型物質的衍射峰的位置、強度、拓撲圖形均存在明顯差異，其中晶Ⅱ型與晶Ⅵ型為晶態(tài)晶型，二者分子有序排列規(guī)律不同，晶Ⅴ型為無定型態(tài)物質。見圖1。

A.晶Ⅱ型；B.晶Ⅴ型；C.晶Ⅵ型

2.2液質條件 色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)，流動相為甲醇-0.1%甲酸溶液(30：70)，流速為0.3 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫35 ℃，質譜信號為ESI 源( 正離子檢測模式)，用于定量分析的離子荷質比為445(芒果苷)、447(內(nèi)標，頭孢呋辛鈉)，裂解電壓150 V，90 V，增益系數(shù)為1.5。干燥氣流為11.0 L·min-1，噴霧室電壓為35 psi，干燥器溫度為350 ℃，毛細管電壓為3000 V(正)、3000 V(負)。

2.3標準溶液及內(nèi)標溶液的配制 精密稱取芒果苷標準品1 mg，加入50%甲醇1 mL充分溶解并混勻，配成1 mg·mL-1的芒果苷母液，臨用時以50%甲醇溶液稀釋成不同濃度的標準溶液。精密稱取頭孢呋辛鈉1 mg，加入甲醇1 mL充分溶解并混勻，配成1 mg·mL-1的頭孢呋辛鈉母液，臨用時以50%甲醇溶液稀釋成1.5 μg·mL-1的內(nèi)標工作液。

2.4血漿樣品處理 精密吸取肝素抗凝血漿100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標頭孢呋辛鈉工作液和1.2 mol·L-1鹽酸溶液各10 μL，再加入乙酸乙酯1 mL，充分震蕩5 min，12 100×g，10 min，取上層溶液950 μL置于離心管中，常溫以氮氣吹干。加入50%甲醇溶液70 μL復溶，震蕩5 min，12 100×g離心5 min，取上層溶液60 μL于內(nèi)襯管中，進樣10 μL。以樣品與內(nèi)標峰面積之比進行定量分析。

2.5方法專屬性考察 分別對空白血漿樣品，芒果苷和內(nèi)標頭孢呋辛鈉工作液，空白血漿樣品加入芒果苷和內(nèi)標頭孢呋辛鈉工作液，大鼠灌胃芒果苷后血漿樣品進行處理并測定。按照“2.4”項下血漿處理方法處理樣品，芒果苷保留時間為4.1 min，內(nèi)標頭孢呋辛鈉保留時間為5.9 min，血漿中內(nèi)源性物質對芒果苷和內(nèi)標頭孢呋辛鈉的色譜峰沒有干擾，說明該方法專屬性良好。LC-MS專屬性考察見圖2。

2.6線性關系考察及最低定量限 用不同濃度的芒果苷標準液分別配制濃度為12.5，25，50，100，200，400，800，1000，1200，1600 μg·L-1的系列血漿樣品，按照“2.4”項下血漿處理方法處理樣品，重復4次，以芒果苷峰面積(Ai)與頭孢呋辛鈉峰面積(As)的比值(Y)對芒果苷濃度(X，μg·L-1)作線性回歸，得回歸方程為Y= 0.0013X+ 0.0541，R2= 0.9991。結果表明芒果苷在12.5～1600 μg·L-1內(nèi)線性關系良好，最低定量限為12.5 μg·L-1。

2.7精密度與準確度實驗 按照“2.4”項對低(25 μg·L-1)、中(400 μg·L-1)、高(1200 μg·L-1)濃度血漿樣品進行處理并測定。一天之內(nèi)重復5次，連續(xù)測定3 d。以測得的芒果苷濃度計算方法的精密度。結果見表1，芒果苷血漿樣品的日內(nèi)精密度RSD為1.75%～6.56%，準確度RE為-1.99%～8.08%；日間精密度RSD為1.06%～3.61%，準確度RE為-2.14%～9.00%，滿足測定要求。見表1。

A.空白血漿；B.空白血漿加入芒果苷和頭孢呋辛鈉；C.灌胃芒果苷晶Ⅱ型后15 min血液加入頭孢呋辛鈉后處理血漿樣品；1.頭孢呋辛鈉；2.芒果苷

圖2芒果苷和內(nèi)標頭孢呋辛鈉血漿LC-MS圖

A.blank plasma sample；B. blank plasma spiked with mangiferin and cefluroxime； C. plasma sample collected at 15 min after oral adminitration of mangiferin (formⅡ) and spiked with cefluroxime；1.cefluroxime；2.mangiferin

Fig.2LC-MSchromatogramofplasmasamplecontainingmangiferinandcefluroxime

表1 芒果苷血漿樣品的日內(nèi)和日間精密度

Tab.1 Intra-day and inter-day precision for mangiferin in plasma sample

表1 芒果苷血漿樣品的日內(nèi)和日間精密度

時間與標準濃度/(μg·L-1)測定濃度/(μg·L-1)準確度(RE)精密度(RSD)%日內(nèi) 2527.02±1.778.086.56 400392.04±7.10-1.991.81 12001225.18±21.522.101.75日間 2527.25±2.939.001.06 400391.43±5.22-2.141.33 12001176.98±42.53-1.923.61

2.8萃取回收率與加樣回收率 取低(25 μg·L-1)、中(400 μg·L-1)、高(1200 μg·L-1)濃度血漿樣品，按“2.4” 項血漿樣品的處理方法進行處理，進行LC-MS 分析，記錄峰面積，與相應濃度芒果苷標準溶液進樣10 μL 所得到的峰面積相比，二者比值即萃取回收率，重復5次。取低(25 μg·L-1)、中(400 μg·L-1)、高(1200 μg·L-1)濃度血漿樣品，按“2.4” 項血漿樣品的處理方法進行處理，利用血漿樣品的峰面積與內(nèi)標峰面積的比值，代入線性方程，計算檢出量，檢出量與加入量的比值即為方法回收率，重復5次。結果見表2，芒果苷血漿樣品萃取回收率為85.01%～96.81%，RSD為1.53%～5.41%；方法回收率為98.01%～108.08%，RSD為1.75%～6.56%，符合方法學要求。見表2。

表2 芒果苷血漿樣品的回收率

Tab.2 Recovery of mangiferin in plasma sample

表2 芒果苷血漿樣品的回收率

給藥濃度/(μg·L-1 )萃取回收率回收率RSD方法回收率回收率RSD2596.81±1.481.53108.08±7.106.5640089.90±4.875.4198.01±1.771.81120085.01±3.614.25102.09±1.791.75

2.9穩(wěn)定性實驗 取低(25 μg·L-1)、中(400 μg·L-1)、高(1200 μg·L-1)的血漿樣品，考察在室溫放置4 h，冰中放置4 h，-20 ℃放置7 d的穩(wěn)定性，每項3個濃度各重復5個。按“2.4” 項血漿樣品的處理方法進行處理，進行HPLC-MS分析。結果見表3，芒果苷含藥血漿在以上貯存條件下穩(wěn)定性良好，能夠滿足測定要求。

表3 芒果苷血漿穩(wěn)定性

Tab.3 Stability of mangiferin in plasma sample

表3 芒果苷血漿穩(wěn)定性

儲存條件與標準濃度/(μg·L-1)測定濃度/( μg·L-1)準確度(RE)精密度(RSD)%室溫放置4 h 2525.79±3.023.1611.73 400400.4±16.350.104.08 12001217.65±2.781.470.23冰中放置4 h 2527.00±0.238.000.84 400452.40±10.7713.102.38 12001285.65±20.787.141.62-20 ℃放置7 d 2526.94±3.837.7614.21 400443.73±19.3810.934.36 12001255.25±73.644.605.87

2.10大鼠對不同晶型芒果苷的吸收 將SD大鼠隨機分組，每組5只，常規(guī)條件飼養(yǎng)，自由飲水，禁食12 h后按照100 mg·kg-1給予不同晶型的芒果苷。于給藥后15，30 min和1，1.5，2，3，4，5，7，9，12，24 h眼后靜脈叢取血約0.4 mL，至肝素化抗凝管，4 500×g，4 ℃離心10 min，取上層血漿凍存于-20 ℃冰箱內(nèi)待測。按照“2.4”項下進行樣品處理與測定，計算芒果苷血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，見圖3。

2.11主要藥動學參數(shù) 利用軟件DAS3.0.7對測得的芒果苷血藥濃度數(shù)據(jù)進行藥動學參數(shù)計算(非房室模型法)。主要藥動學參數(shù)結果見表4。從結果可以看出，大鼠口服芒果苷不同晶型物質后在體內(nèi)同一時間點的血藥濃度存在一定差異，表明芒果苷晶型狀態(tài)對大鼠體內(nèi)的吸收量和吸收速率產(chǎn)生一定的影響。大鼠分別口服3種晶型芒果苷后，均在1 h內(nèi)血藥濃度達到峰值，其中晶Ⅴ型峰面積AUC(0-24 h)最大，峰濃度Cmax最高。

3 討論

本實驗在參考相關文獻基礎上[13-14]，對萃取和流動相條件進行改進，建立了一種準確、簡單、高效、結果可靠的大鼠血漿芒果苷測定方法。在血漿樣品中加入少量鹽酸溶液，可有效提高乙酸乙酯對藥物的萃取效率。在流動相中加入甲酸調節(jié)極性，使出峰時間較為合理，有效分開藥物峰與血漿雜質峰。

通過該方法對芒果苷不同晶型物質大鼠體內(nèi)藥動學進行考察，比較芒果苷不同晶型物質在大鼠體內(nèi)的代謝過程。對于口服固體晶型藥物在體內(nèi)生物活性的研究，關鍵在于如何保證化合物在給藥過程中的晶型保持不變。藥物不同晶型物質在完全溶解后進入體內(nèi)，一般不再具有吸收的差異，即使采用混懸的方式給藥，由于藥物本身存在一定的溶解度及與溶液接觸等因素，可能導致晶型發(fā)生改變，不能準確反映晶型物質的真實吸收特點，從而影響優(yōu)勢藥物晶型的選擇[15]。本實驗采用小動物固體灌胃器，可以定量地將藥物以固體形式灌胃給予大鼠，從而有效考察不同晶型物質在體內(nèi)的藥動學參數(shù)，保證生物學評價的真實性、有效性與準確性。

表4 芒果苷3種晶型物質的主要藥動學參數(shù)

Tab.4 Pharmacokinetic parameters of three kinds of mangiferin polymorphs

表4 芒果苷3種晶型物質的主要藥動學參數(shù)

分型AUC(0-24 h)/(ng·mL-1·h)Cmax/( μg·L-1)tmaxt1/2MRT0-thCLz/F/(L·h-1·kg-1)晶Ⅱ型1 323.27±218.07321.92±85.180.70±0.452.78±1.725.28±0.9676.00±13.28晶Ⅴ型1 974.34±469.24455.83±277.070.50±0.325.29±2.676.41±0.9846.34±20.15晶Ⅵ型1 737.79±623.06319.92±86.070.50±0.345.31±2.827.10±0.7460.47±23.67

優(yōu)勢藥物晶型是指在固體化學藥物存在多種晶型狀態(tài)的情況下，其中穩(wěn)定性符合藥用要求、臨床療效最佳、安全性最高、最適合用于制備藥品的晶型狀態(tài)。符合優(yōu)勢藥物晶型的重要條件包括具有良好的生物學活性和臨床治療效果，穩(wěn)定性符合制藥要求，制備工藝可實施，質量可控[11]。當然，優(yōu)勢藥物晶型物質狀態(tài)可以是一種或多種，可選擇一種晶型作為藥用晶型物質，亦可按一定比例選擇兩種或多種晶型物質的混合狀態(tài)作為藥用晶型物質使用[16]。芒果苷3種晶型物質AUC(0-24 h)為1323.27～1737.79 ng·mL-1·h，tmax為0.5～0.7 h，Cmax為319.92～455.83 μg·L-1。比較以上統(tǒng)計結果發(fā)現(xiàn)，芒果苷3種晶型出現(xiàn)不同的藥物吸收，各晶型物質藥動學差異明顯，其中晶Ⅴ型芒果苷AUC(0-24 h)和Cmax最大，可能成為芒果苷潛在的優(yōu)勢藥物晶型。