于洪蓮

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東 珠海 519060）

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和飼料生產(chǎn)水平的提高，植酸酶作為一種綠色環(huán)保型添加劑廣泛應(yīng)用于單胃動(dòng)物飼料中，其通過催化將飼料原料中豐富的植酸及植酸鹽分解為能被動(dòng)物利用的無機(jī)磷和肌醇，可有效提高植物性飼料中磷、礦物質(zhì)元素和蛋白質(zhì)的可利用率，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，因此植酸酶在飼料生產(chǎn)中可定量取代或減少無機(jī)磷的添加量，在降低畜禽養(yǎng)殖成本的同時(shí)還減少了動(dòng)物糞便中磷的排放量，減輕磷對(duì)環(huán)境污染。植酸酶的研究對(duì)解決環(huán)境污染和滿足營養(yǎng)需求方面有著重要意義。

飼用酶制劑活性分析與檢測在飼料工業(yè)中具有重要的作用，酶制劑生產(chǎn)企業(yè)通過檢測產(chǎn)品酶活力來監(jiān)控產(chǎn)品穩(wěn)定性，保證酶制劑產(chǎn)品品質(zhì)，飼料生產(chǎn)企業(yè)需要通過檢測飼料產(chǎn)品中酶制劑的含量來驗(yàn)證其添加效果（即飼料中酶的活力保存率），以保障飼料品質(zhì)，因此酶活力的測定是控制酶制劑產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是使用效果的基本保障。如何準(zhǔn)確檢測植酸酶含量是許多飼用酶制劑工作者普遍關(guān)心的問題。本文以國標(biāo)檢測方法為依據(jù)，綜述了植酸酶活力測定方法及檢測中關(guān)鍵控制點(diǎn)，以期為植酸酶的檢測提供可行性參考。

1 植酸酶活性測定的方法及原理

1.1 測定方法

《飼用植酸酶活性的測定分光光度法》是現(xiàn)行有效的飼用植酸酶活性測定的國標(biāo)方法，即GB/T 18634-2009。本文以國標(biāo)檢測方法為依據(jù)。

1.2 測定原理

依據(jù)國標(biāo)檢測方法，其原理為：植酸酶在一定溫度和pH條件下，將底物植酸水解，生成正磷酸和肌醇衍生物。在酸性溶液中，能與釩鉬酸銨生成黃色的復(fù)合物，可于波長415 nm下進(jìn)行比色測定[1]。

1.3 植酸酶活性單位

酶活性單位定義為：樣品在37 ℃、pH 5.5 的條件下，每分鐘從濃度為5.0 mmol·L-1植酸鈉溶液中釋放出1 μmol 無機(jī)磷，即為一個(gè)植酸酶活性單位，以U表示[1]。

2 植酸酶活性測定的關(guān)鍵控制點(diǎn)

影響植酸酶活性測定的因素很多，如標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、試樣溶液的制備、乙酸緩沖溶液及底物植酸鈉溶液的配制、溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間、離心速度和時(shí)間的控制等，這些在酶促反應(yīng)過程中直接影響反應(yīng)速率。下面具體介紹飼用植酸酶活性測定的關(guān)鍵控制點(diǎn)。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

嚴(yán)格按照實(shí)國標(biāo)方法中規(guī)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，基準(zhǔn)物磷酸二氫鉀需預(yù)先在（105±2）℃電熱干燥箱中干燥至恒重，標(biāo)準(zhǔn)品的稱量要使用感量為0.000 1 g的分析天平。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2＞0.999，否則需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。新配試劑或更換化驗(yàn)員都需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 試樣溶液的制備

試樣溶液濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響：如果其他條件都是適宜的話，在一定范圍內(nèi)隨著試樣溶液的濃度的增加，酶促反應(yīng)速率隨試樣溶液濃度增加而加快，當(dāng)試樣溶液達(dá)到一定濃度時(shí)，受底物數(shù)量限制，酶促反應(yīng)速率將不再增加，酶活性的測定結(jié)果就不準(zhǔn)確，因此要從以下幾方面控制試樣溶液濃度。

2.2.1 酶的提取

按國標(biāo)的建議稱樣量稱取植酸酶試樣（包被植酸酶樣品需要研磨處理）兩份，精確至0.000 1 g，置于100 mL 容量瓶中，加入乙酸緩沖溶液搖勻并定容至刻度，放入一個(gè)磁力攪拌子，在磁力攪拌器上高速攪拌30 min。液體樣品無需提取直接稀釋備用。攪拌時(shí)間不夠或攪拌速度過低都會(huì)使得酶未完全提取引起檢測結(jié)果偏差，而提取過程攪拌速度過快會(huì)導(dǎo)致液體飛濺使得酶活檢測不準(zhǔn)確，因此需要保證提取時(shí)間及適宜的攪拌速度。注意乙酸緩沖液含有曲拉通和牛血清白蛋白（BSA）成分，在轉(zhuǎn)移或振蕩過程中會(huì)產(chǎn)生較多的泡沫，所以在稀釋過程中應(yīng)盡量避免因泡沫的體積誤差造成稀釋倍數(shù)低，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差。

2.2.2 試樣溶液稀釋

稀釋倍數(shù)的確定主要依據(jù)主要產(chǎn)品推薦酶活性或標(biāo)示量、稱樣量和國標(biāo)方法中要求的試樣溶液濃度確定的。國標(biāo)方法中規(guī)定最終試樣溶液濃度應(yīng)保持在約0.4 U·mL-1，試樣溶液稀釋倍數(shù)計(jì)算公式為：試樣溶液稀釋倍數(shù)=估計(jì)酶活力×稱樣量/0.4。如：植酸酶估計(jì)酶活力為5 000 U·g-1，稱樣量為1.0 g，其稀釋倍數(shù)=5 000×1.0/0.4=12 500。試樣酶在提取時(shí)已稀釋100倍，提取后的試樣在離心機(jī)上以4 000 r·min-1離心10 min，分取不同體積的上清液用緩沖溶液進(jìn)行逐步進(jìn)行稀釋至12 500倍，移液過程要求準(zhǔn)確無誤，渦旋混合均勻。

2.3 乙酸緩沖溶液配制

乙酸緩沖溶液是確保整個(gè)酶促反應(yīng)體系pH 的關(guān)鍵因素，需要準(zhǔn)確配制后調(diào)節(jié)pH 為5.50。調(diào)節(jié)配制溶液pH 使用的酸度計(jì)必須校準(zhǔn)，所用復(fù)合電極必須在使用壽命內(nèi)。盡管乙酸緩沖溶液在密閉的容器內(nèi)室溫下可存放2個(gè)月有效，但存放期＞1個(gè)月，建議重新確認(rèn)pH，如果有變化，需要重新調(diào)節(jié)pH。

2.4 底物植酸鈉溶液的配制

2.4.1 底物植酸鈉的型號(hào)選擇

植酸鈉是影響植酸酶活性測定結(jié)果的重要因素，李富偉等研究顯示，不同型號(hào)的植酸鈉對(duì)測定結(jié)果的影響是顯著的[2]。因此在酶活性測定中需遵照《飼用植酸酶活性測定分光光度法》（GB/T18634-2009）中規(guī)定植酸鈉（相對(duì)分子質(zhì)量為923.8、純度為95%）來選擇底物。在測定過程中，如果更換底物的生產(chǎn)廠家、型號(hào)及批次，必須對(duì)新的植酸鈉底物進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)校正，選擇適宜的植酸鈉底物以便得到正確和統(tǒng)一的酶活性測定結(jié)果，這樣才有利于確定植酸酶作為飼料添加劑時(shí)的準(zhǔn)確添加量。

2.4.2 底物溶液濃度

底物濃度是植酸酶活性測定的關(guān)鍵要素。閔兆升等研究表明，底物濃度較低時(shí)不能使植酸酶完全催化，但高底物濃度對(duì)植酸酶的催化活性也有抑制作用[3]。在底物濃度為0～4.8 mmol·L-1時(shí)，酶促反應(yīng)速率隨著底物濃度的增加而加快，反應(yīng)速度與底物濃度近乎成正比；底物濃度為4.8～6.6 mmol·L-1時(shí)，反應(yīng)速率變化不顯著，維持一個(gè)較平穩(wěn)的狀態(tài)；當(dāng)?shù)孜餄舛龋?.6 mmol·L-1時(shí)，酶促反應(yīng)速率隨底物濃度的增大而急劇減緩，說明高濃度底物對(duì)酶促反應(yīng)存在抑制作用，因此需要依據(jù)國標(biāo)要求控制底物植酸鈉溶液濃度，植酸鈉底物配制濃度為7.5 mmol·L-1，實(shí)際最終反應(yīng)濃度為5 mmol·L-1，保證底物濃度是過量的，使得酶促反應(yīng)充分，得到準(zhǔn)確的植酸酶活性測定結(jié)果。

2.4.3 底物pH

植酸鈉是一種強(qiáng)堿性弱酸鹽，溶解于水后顯堿性。按國標(biāo)要求使用乙酸緩沖液（1）配制的，但用已校準(zhǔn)過的酸度計(jì)檢測配制后溶液的pH 已偏離5.50，實(shí)驗(yàn)室配制完的底物溶液的pH 約為7.50，需用18%的冰乙酸溶液（避免使用低濃度乙酸調(diào)節(jié)pH）單向調(diào)節(jié)pH 至5.50。植酸鈉溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用。另注意酸度計(jì)的日常維護(hù)，電極需浸泡在電極保護(hù)液中，測定過酶液、pH過高、pH過低或者黏度很大的樣品后，電極反應(yīng)會(huì)變得遲鈍，所以一定要仔細(xì)沖洗電極，必要時(shí)電極需要用強(qiáng)酸浸泡清洗，還要用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校準(zhǔn)，才能保證用配制的溶液符合植酸酶活性測定的要求。

2.5 溫度控制

在一定溫度范圍內(nèi)酶促反應(yīng)速度隨溫度的升高而加快，但當(dāng)溫度升高到一定值時(shí)，酶促反應(yīng)速度不再加快反而隨著溫度的升高而下降。植酸酶活性測定過程中溫度是非常關(guān)鍵因素，溫度過低或過高都會(huì)影響酶促反應(yīng)速率，因此在檢測過程中溫度應(yīng)控制在37 ℃。水浴鍋的溫度要用標(biāo)準(zhǔn)溫度計(jì)進(jìn)行測量校準(zhǔn)。保證試樣溶液及底物溶液按標(biāo)準(zhǔn)要求預(yù)熱。恒溫水浴鍋內(nèi)水的液面要高于試管內(nèi)反應(yīng)液的液面。為了維持水浴的均衡，有條件的實(shí)驗(yàn)室最好采用循環(huán)水流或振蕩水浴。

2.6 反應(yīng)時(shí)間控制

酶活性測定過程中反應(yīng)時(shí)間是一個(gè)非常重要的因素，要求各反應(yīng)管反應(yīng)時(shí)間一致均嚴(yán)格控制在30 min。為了確保獲得精確的測定結(jié)果，在反應(yīng)過程中，從反應(yīng)物混合開始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，向每支試管中加入試劑的時(shí)間間隔要一致，且時(shí)間間隔要充足，預(yù)留出完成下步所需要的時(shí)間。

2.7 酶解反應(yīng)終止及顯色液的配制

終止顯色液混合順序，1份鉬酸銨溶液+1份偏釩酸銨溶液，最后加入2份硝酸溶液混合均勻后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。使用溫水（50～60 ℃）配制偏釩酸銨溶液，易溶解且穩(wěn)定，配制好的溶液棕色試劑瓶避光保存。

2.8 離心速度和時(shí)間的控制

國標(biāo)方法中規(guī)定酶促反應(yīng)中之后，反應(yīng)后的試液需在室溫下靜置10 min，如出現(xiàn)渾濁需在離心機(jī)上以4 000 r·min-1離心10 min。在日常實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)室溫靜置或以3 000 r·min-1離心10 min，會(huì)導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度不呈梯度。若以5 000 r·min-1離心10 min時(shí)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線各梯度的吸光度要低于以4 000 r·min-1離心10 min，因此在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制空白管和樣品管離心速度和時(shí)間為4 000 r·min-1離心10 min。

2.9 紫外分光光度計(jì)測定吸光值

酶促反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)在1 h 內(nèi)離心測定吸光度，取上清液以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白調(diào)零，在紫外分光光度計(jì)415 nm 波長測定試樣空白和試樣溶液的吸光值。注意試樣溶液與式樣空白必須澄清，不得有渾濁，測定前用待測溶液潤洗比色皿1次，減少誤差。吸光度應(yīng)控制在0.2～0.4，此區(qū)間計(jì)算的結(jié)果誤差較小。在檢測植酸酶樣品時(shí)，酶活性的標(biāo)示量與實(shí)際含量可能會(huì)差異很大，會(huì)導(dǎo)致吸光值或高或低，吸光值未在范圍內(nèi)，需要重新調(diào)整試樣溶液的稀釋倍數(shù)再進(jìn)行檢測。

2.10 檢測結(jié)果的判定

檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定主要可通過以下幾方面進(jìn)行衡量檢驗(yàn)。

2.10.1 測定結(jié)果重復(fù)性

測定結(jié)果重復(fù)性主要是通過平行試樣測定結(jié)果間相對(duì)偏差大小來考證。標(biāo)準(zhǔn)要求同一試樣兩個(gè)平行測定值的相對(duì)偏差應(yīng)≤8%，如超出這個(gè)范圍需要重新測定酶活性。

2.10.2 測定結(jié)果的再現(xiàn)性

不同工作日或不同分析人員間測定結(jié)果的分析比較來評(píng)價(jià)酶活性測定結(jié)果的再現(xiàn)性[4]。

2.10.3 測定結(jié)果的準(zhǔn)確性

實(shí)驗(yàn)室需要在測定時(shí)加1個(gè)已知活性的植酸酶參考樣，便于檢驗(yàn)整個(gè)過程是否偏離。如果檢測中發(fā)現(xiàn)已知酶活檢測結(jié)果未在誤差范圍內(nèi)，應(yīng)查找原因后再安排檢測。在實(shí)驗(yàn)室酶活測定過程中，存在很多隨機(jī)因素，每次實(shí)驗(yàn)測定帶參考樣是一項(xiàng)非常有效的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制措施。

參考樣需兩位實(shí)驗(yàn)員5 次平行實(shí)驗(yàn)檢測獲得，取平均酶活力作為參考標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照樣要分裝密封置于-25 ℃急凍保存。

2.11 其他關(guān)鍵因素

2.11.1 要求無磷污染

測定過程中要使用無磷水。清洗實(shí)驗(yàn)器皿要無磷的清洗劑，反應(yīng)離心管清洗后需沸水浴5 min，使用1周后應(yīng)洗液浸泡，避免平行樣偏差較大導(dǎo)致結(jié)果偏低。

2.11.2 對(duì)化驗(yàn)員的要求

植酸酶活性的測定要求化驗(yàn)員注重工作細(xì)節(jié)，例如試樣、試劑稱量或配制的精確性，pH 的調(diào)節(jié)的準(zhǔn)確性，移液和計(jì)時(shí)的準(zhǔn)確性，分析和解決問題的及時(shí)性。

3 小 結(jié)

植酸酶活性的測定在植酸酶產(chǎn)品的質(zhì)量控制、產(chǎn)品標(biāo)簽、酶活力保證及實(shí)際應(yīng)用都有著重要的作用[5]。采用國標(biāo)法測定植酸酶活性時(shí)應(yīng)注意以上事項(xiàng)，以在檢測植酸酶活性中獲得準(zhǔn)確和重復(fù)性好的分析結(jié)果。