白雪娟 劉銀萍 張俊仙 王杰 吳雪瓊

我國結核病的耐藥情況相當嚴重，據(jù)2018年世界衛(wèi)生組織估算，2017年我國新發(fā)結核病患者88.9萬例，在新發(fā)和已治療結核病患者中耐多藥結核病(MDR-TB)和單耐利福平結核病(RR-TB)的發(fā)生率分別是7.1%和24%，是全球30個MDR-TB高負擔國家之一[1]。MDR-TB是指患者體內(nèi)的結核分枝桿菌(MTB)同時對一線抗結核藥物利福平(RFP)和異煙肼(INH)耐受，是目前結核病臨床治療中亟待解決的難題之一。通過藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)快速診斷MDR-TB，以指導臨床制定合理、有效的化療方案是控制MDR-TB的關鍵。

目前，臨床上常用的藥敏試驗方法主要包括表型方法和分子生物學方法，均有相關的商業(yè)化產(chǎn)品。表型方法可同時檢測MTB對10多種抗結核藥物的耐藥水平，但需要在培養(yǎng)基礎上進行檢測，需較長時間；分子生物學方法通過快速檢測MTB耐藥相關基因突變而診斷耐藥，敏感度高，但檢測的藥物種類有限。這兩種方法聯(lián)合檢測，取長補短，在MDR-TB的診斷和治療方面發(fā)揮著重要的作用。筆者通過傳統(tǒng)的絕對濃度法藥敏試驗對125例培養(yǎng)陽性的臨床標本進行RFP和INH藥敏試驗，了解其耐藥水平；并通過MTB耐藥基因芯片分析臨床標本中MTBrpoB、katG和inhA基因突變情況，研究這些耐藥相關基因突變對RFP和INH耐藥之間的關系，探討其臨床意義。

資料和方法

一、患者來源

回顧性調(diào)查2014年8月至2015年9月解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心(原解放軍第三〇九醫(yī)院)全軍結核病研究所住院患者125例。

二、納入標準

(1)根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準《WS 288—2017肺結核診斷 》[2]和中華醫(yī)學會《臨床診療指南：結核病學分冊》[3]確診的結核病患者；(2)BACTEC MGIT 960系統(tǒng)快速培養(yǎng)陽性，并菌種鑒定為MTB；(3)患者的臨床標本同時開展了傳統(tǒng)的藥敏試驗和MTB耐藥基因芯片檢測。

三、一般資料

本研究共收集符合上述納入標準的結核病患者125例，其中男77例，女48例，年齡18～84歲，平均年齡(45.0±19.5)歲。經(jīng)細菌學檢查等確診為肺結核49例、肺結核并發(fā)結核性胸膜炎31例、肺結核并發(fā)氣管支氣管結核20例、肺結核并發(fā)骨關節(jié)結核5例、骨關節(jié)結核7例、肺結核并發(fā)淋巴結結核3例、泌尿系結核3例、肺結核并發(fā)結核性心包炎2例、血行播散性肺結核并發(fā)結核性腦膜腦炎、繼發(fā)性肺結核并發(fā)腎結核、結核性胸膜炎、腹-盆腔結核和淋巴結結核各1例。其中痰標本90例、支氣管灌洗液12例、膿液12例、胸腔積液6例、組織3例、腹腔積液和尿液各1例。對上述患者的絕對濃度法藥敏試驗和MTB耐藥基因芯片檢測結果進行分析。

四、實驗方法

1.標本的培養(yǎng)：根據(jù)《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[4]，應用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)快速進行硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)分枝桿菌鑒別培養(yǎng)，PNB陰性、TCH陽性或陰性的生長物經(jīng)抗酸染色證實為MTB或牛分枝桿菌；41 d仍無MTB生長的報告為陰性。

2. 絕對濃度法藥敏試驗：將BACTEC MGIT 960系統(tǒng)快速培養(yǎng)陽性的培養(yǎng)管離心沉淀，將沉淀物根據(jù)珠海銀科醫(yī)學工程股份有限公司的分枝桿菌羅氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)法)說明書進行藥敏試驗，耐藥標準判定：高、低度耐INH分別為1 μg/ml和10 μg/ml；高、低度耐RFP分別為250 μg/ml和50 μg/ml。

3. 應用基因芯片檢測MTB耐多藥基因型：按照博奧生物集團有限公司的不同臨床樣本核酸提取試劑盒說明書提取臨床標本中的MTB-DNA，然后應用分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)進行核酸檢測；若MTB核酸檢測陽性，進一步按照晶芯?結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒(DNA微陣列芯片法)的說明書進行PCR擴增和芯片雜交，檢測RFP的rpoB和INH的katG及inhA基因啟動子的耐藥基因型(圖1)。

五、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、 應用絕對濃度法藥敏試驗檢測MTB對RFP、INH的耐藥情況

經(jīng)PNB、TCH鑒別為MTB的125例患者的臨床標本，通過絕對濃度法藥敏試驗同時對RFP、INH進行檢測，結果顯示對RFP的耐藥率為20.0% [25/125，其中高耐占88.0%(22/25)、低耐占12.0%(3/25)，高耐的發(fā)生率明顯高于低耐(χ2=25.920，P=0.000)]，INH耐藥率為17.6% [22/125，其中高耐占18.2%(4/22)、低耐占81.8%(18/22)，低耐的發(fā)生率明顯高于高耐(χ2=15.363，P=0.000)]，耐多藥率為16.8%(21/125)，耐多藥/單耐RFP(MDR/RR-MTB)發(fā)生率為20.0%(25/125)(表1)。

12345678910 1234567891011121314QCECBCrpoB IC分枝桿菌屬結核分枝桿菌511 WT(CTG)511(CTG→CCG)513 WT(CAA)513(CAA→AAA)516 WT(GAC)513(CAA→CCA)533 WT(CTG)533(CTG→CCG)531 WT(TCG)531(TCG→TTG)526 WT(CAC)531(TCG→TGG)526(CAC→TAC)526(CAC→GAC)526(CAC→CTC)526(CAC→CGC)516(GAC→GTC)516(GAC→TAC)516(GAC→GGC)NCECQC12345678910 12345678QCECBCBC分枝桿菌屬結核分枝桿菌katG ICinhA ICkatG 315 WT(AGC)inhA-15 WT(C)katG 315(AGC→ACC)inhA-15(C→T)katG 315(AGC→AAC)NCECQC

(1)RFP耐藥相關的rpoB基因(2)INH耐藥相關的katG基因和inhA基因啟動子

注圖片來自“晶芯?結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒說明書”。QC：表面化學質(zhì)控探針；EC：雜交陽性外對照探針；BC：空白對照；NC：陰性對照探針；IC：內(nèi)對照探針；WT：野生型。上方和左側的數(shù)字代表微陣列芯片上的檢測點，檢測探針和對照探針各重復5個點

圖1 DNA微陣列芯片上檢測的MTB耐藥基因型排布示意圖

注耐藥標準判定：RFP高、低度耐藥濃度分別為250 μg/ml和 50 μg/ml；INH高、低度耐藥濃度分別為1 μg/ml和10 μg/ml

表2 125例初、復治結核病患者臨床標本采用絕對濃度法藥敏試驗對RFP和INH的檢測結果

125例結核病患者中，初治和復治患者分別占73.6%(92/125)、26.4%(33/125)，其絕對濃度法藥敏試驗結果見表2。初治結核病患者MDR/RR-MTB的發(fā)生率(10.9%，10/92)明顯低于復治結核病患者(45.5%，15/33)(χ2=16.060，P=0.000)。

二、RFP和INH耐藥基因型檢測

應用基因芯片檢測125例MTBrpoB基因、katG基因315位點和inhA基因-15位突變情況見表3，這3個基因總突變率分別為21.6%(27/125)、14.4%(18/125)、8.8%(11/125)，katG和inhA合計突變率為22.4%(28/125)。RFP、INH耐藥基因芯片檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和一致率見表4。

以絕對濃度法藥敏試驗結果為對照，100例RFP敏感的臨床標本中，91例rpoB為野生型，特異度為91.0%(91/100)，發(fā)現(xiàn)rpoB531位TCG>TTG突變7例(7.0%)、526位CAC>TAC和513位CAA>CCA突變各1例；25例RFP耐藥的臨床標本中，18例rpoB為突變基因型，敏感度為72.0%(18/25)，其中rpoB531位TCG>TTG突變占77.8%(14/18)，526位CAC>TAC 或CGC 突變占16.7%(3/18)，531位并發(fā)516位GAC>TAC突變占5.6%(1/18)。22例高耐RFP標本中，rpoB突變率占72.7%(16/22)；3例低耐RFP標本中， 2例rpoB突變率占66.7%(2/3)。125例臨床標本中， 531位和526位密碼子突變者26例，其中高耐RFP者占61.5%(16/26)，低耐RFP者占7.7%(2/26)，RFP敏感的占30.8%(8/26)。

以絕對濃度法藥敏試驗結果為對照，103例INH敏感的臨床標本中，89例katG和inhA均為野生型，特異度為86.4%(89/103)，發(fā)現(xiàn)katG315位AGC>ACC突變7例(6.8%)，inhA-15位C>T突變7例(6.8%)；22例INH耐藥的臨床標本中，14例katG或inhA為突變基因型，敏感度為63.6%(14/22)，其中katG315位AGC>ACC突變占71.4%(10/14)，inhA-15位C>T突變占21.4%(3/14)，katG和inhA雙位點突變占7.1%(1/14)。4例高耐INH標本中，3例katG和inhA突變；18例低耐INH標本中，katG和inhA總突變率為61.1%(11/18)。125例臨床標本中，katG和(或)inhA位點突變者28例，其中高耐INH者占10.7%(3/28)，低耐INH者占39.3%(11/28)，INH敏感者占50.0%(14/28)。

以絕對濃度法藥敏試驗結果為對照，104例非MDR-TB標本中，11例RFP和INH耐藥基因均存在突變，特異度為89.4%(93/104)；21例MDR-TB標本中，RFP和INH耐藥基因均突變的發(fā)生率為61.9%(13/21)，只有RFP耐藥基因突變的發(fā)生率為9.5%(2/21)，未檢出耐藥基因突變的發(fā)生率為28.6%(6/21)。

討 論

RFP和INH均是結核病標準化療方案中的核心抗結核藥物，如果患者同時對RFP和INH耐藥采用標準化療方案治療無效，就需要按照MDR-TB長療程的化療方案治療[5]。因此，快速發(fā)現(xiàn)MDR-TB患者、早期開展有效治療對于MDR-TB的控制、避免MDR-MTB的播散是至關重要的。

我國是耐藥結核病高負擔國家之一，本研究的耐多藥率為16.8%，與高會霞等[6]的報道相似(15.0%)。本研究初治結核病患者MDR-MTB的檢出率(7.6%)，略高于2007—2008年我國結核病耐藥性基線調(diào)查報告(5.7%)[7]和高會霞等(6.3%)[6]的報道，但低于《2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調(diào)查報告》(簡稱《流調(diào)報告》)的數(shù)據(jù)(11.6%)[8]；而復治結核病患者MDR-MTB的檢出率本研究(39.4%)低于高會霞等[6]的報道(44.9%)，但高于2007—2008年我國結核病耐藥性基線調(diào)查報告(25.6%)和2010年我國的《流調(diào)報告》數(shù)據(jù)(35.9%)[8]。本研究初、復治結核病患者MDR/RR-MTB的發(fā)生率(10.9%、45.5%)均高于2018年WHO的報道(7.1%、24%)[1]；本研究復治患者明顯高于全國《流調(diào)報告》的數(shù)據(jù)，可能是這些患者大多是來自全國各地的難治結核病患者所致。這些結果表明復治結核病患者的耐多藥率高于初治結核病患者，獲得性耐藥是我國MDR-TB的主要原因，但原發(fā)性耐藥也不容忽視。

表3 125例臨床標本對RFP、INH采用絕對濃度法藥敏試驗和耐藥基因芯片檢測結果比較

表4 125例結核病患者以絕對濃度法藥敏試驗為標準采用耐藥基因芯片檢測RFP、INH耐藥性的效能

注括號內(nèi)數(shù)值為藥敏試驗不同結果的總例數(shù)；敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%=d/(d+b)×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%=a/(a+b)×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%=d/(d+c)×100%；一致率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%=(a+d)/(a+b+c+d)×100%

本研究耐藥基因芯片檢測與絕對濃度法藥敏試驗結果存在差異的原因分析如下：(1)兩種方法的檢測原理不同；(2)標本中結核分枝桿菌存在異質(zhì)性耐藥[9]；(3)絕對濃度法藥敏試驗是對臨床分離株進行分析，而耐藥基因芯片是直接從臨床標本中提取核酸進行檢測。本研究應用耐藥基因芯片檢測MTB對RFP、INH耐藥和MDR的結果與固體絕對濃度法藥敏試驗的一致率(87.2%、82.4%和84.8%)低于林明冠等[10]的報道(93.8%、89.0%和95.5%)和歐維正等[11]的報道(RFP 93.27%、INH 95.11%)，這可能是因為本研究是直接檢測核酸擴增陽性的臨床標本中的MTB-DNA，而林明冠等[10]和歐維正等[11]是檢測MTB分離株的DNA所致。盡管應用基因芯片直接檢測臨床標本中MTB對RFP、INH的耐藥性較檢測臨床分離株低，但無需培養(yǎng)環(huán)節(jié)，而顯著縮短了檢測時間(由30 d縮短至1 d)，可為臨床快速提供耐藥結核病的診斷依據(jù)，是對傳統(tǒng)表型藥敏試驗的有益補充。

目前，國內(nèi)外大量的研究數(shù)據(jù)均證明95%左右的MTB耐RFP是由于RNA聚合酶β亞單位編碼基因rpoB507至533位氨基酸密碼子的突變所致[12-13]。李麗等[14]通過PubMed數(shù)據(jù)庫檢索了54篇我國關于MTBrpoB耐藥決定區(qū)突變情況的研究報道，分析了我國4149株MTB對RFP耐藥株的分子特征，結果顯示531位(52.49%)、526位(24.66%)和516位(9.26%)氨基酸密碼子是最常見的突變位點，與筆者的研究結論一致(531位、526位突變發(fā)生率分別為77.8%和16.7%)。在我國531位的突變發(fā)生率高于526位密碼子，而國外部分國家526位密碼子的突變發(fā)生率高于531位密碼子[15]。目前研究表明，531位和526位密碼子突變通常導致MTB對RFP高水平耐藥[16]；筆者的研究結果顯示，26例531位和526位密碼子突變患者中高耐RFP的占61.5%(16/26)，與該結論一致。但國內(nèi)外研究均已顯示在表型藥敏試驗顯示為RFP敏感的菌株中也發(fā)現(xiàn)有RFP耐藥決定區(qū)突變的現(xiàn)象[17-19]，孟繁榮等[17]通過PubMed數(shù)據(jù)庫檢索36篇關于MTBrpoB基因突變的研究文獻，其中5136株MTB對RFP敏感株中，38株(0.74%)存在rpoB耐藥決定區(qū)突變，突變位點包括511、533、531、526、516、518、519、521位等密碼子；本研究100例RFP敏感的臨床標本中，9例(9.0%)有rpoB531位(7.0%)、526位(1.0%)和513位(1.0%)突變，這種現(xiàn)象可能是因為基因沉默突變或者是傳統(tǒng)藥敏試驗不準確所致[19]。此外，表2結果顯示初治和復治結核病患者單耐RFP的發(fā)生率分別為3.3%和6.1%，而Mukinda等[20]報道的單耐RFP的發(fā)生率高達12%。因此，不建議將RFP耐藥作為MDR-TB的標志，以免導致不必要的過度治療。

本研究應用基因芯片直接檢測臨床標本中MTB對INH耐藥基因突變的結果與目前的研究結論相一致，最常見的突變位點是katG315位密碼子(71.4%)，其次是inhA-15位核苷酸突變(21.4%)，但胡曉紅等[21]報道的katG315突變率(54.7%)低于本研究，而inhA-15突變率(43.8%)高于本研究，說明不同地區(qū)MTB耐藥基因突變情況存在一定的差異。目前研究表明，katG315位密碼子和inhA-15突變通常導致MTB對INH低水平耐受或敏感[22]，本研究結果顯示28例這兩個位點突變的患者中，低耐INH和敏感者占89.3%(25/28)，與該結論一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在INH絕對濃度法藥敏試驗檢測敏感的臨床標本中，發(fā)現(xiàn)約13.6%的菌株也存在katG315位和inhA-15位突變的情況，明顯高于胡曉紅等[21]、萬智敏[23]采用比例法與基因芯片檢測比較的結果(1.6%～3.3%)，分析其原因如下：(1)katG315位突變只是使其編碼的過氧化氫酶和過氧化物酶活性降低，仍能將異煙肼轉化為其活性型異煙酸[24]，因此，部分轉化率降低不是很明顯的菌株在表型藥敏試驗中可能表現(xiàn)為敏感；(2)inhA-15 位核苷酸突變通常導致低耐INH，如萬智敏[23]的研究顯示，katG和inhA野生型的MIC值為(0.06±0.05) μg/ml，inhA-15(C→T)突變菌株MIC值為(0.37±0.09) μg/ml,46株KatG315(G→C/A)突變株MIC值為(5.76±4.06) μg/ml；(3)本研究采用含藥的固體培養(yǎng)基進行絕對濃度法藥敏試驗，如果接種菌量較小，也可能會出現(xiàn)假敏感。

總之，本研究應用耐藥基因芯片直接檢測結核病患者臨床標本中MTB 對RFP和INH耐藥的相關基因突變具有中等的敏感度和較高的特異度，可快速檢出對RFP、INH耐藥和MDR-TB患者，為臨床早期開展有效化療提供實驗依據(jù)。