陳忠南 易松林 胡培磊 郭靖瑋 余艷艷 劉彬彬 易環(huán) 楊坤云 譚云洪

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)系指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。目前，歐美國家和亞洲國家NTM肺病的發(fā)病率逐年上升，包括我國在內(nèi)的亞洲地區(qū)，NTM的感染率也在上升[1]。NTM肺病具有與結(jié)核病臨床表現(xiàn)相似的全身中毒癥狀和局部損傷表現(xiàn)，主要侵犯肺部。在無菌種鑒定結(jié)果的情況下，痰涂片抗酸染色和分枝桿菌培養(yǎng)難以區(qū)別NTM和結(jié)核分枝桿菌，造成痰涂片抗酸染色或分枝桿菌培養(yǎng)陽性患者誤診為結(jié)核病而持續(xù)地給予抗結(jié)核藥物治療，甚至誤診為耐藥結(jié)核病而長期給予耐多藥結(jié)核病方案進行治療[2]。 NTM的分布具有明顯的地域差異，不同地區(qū)的感染率、發(fā)病率和流行菌種各有特點[3]。筆者參考《結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程》[4]、《非結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定技術(shù)》[5]對2012—2017年湖南省經(jīng)BACTEC MGIT 960培養(yǎng)分離出的分枝桿菌菌株采用MPB64蛋白免疫膠體金法、對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗進行MTBC與NTM初步鑒別，應(yīng)用16S rRNA、Hsp65測序法將NTM鑒定到種水平，分析NTM感染患者的相關(guān)臨床資料，以了解湖南省NTM的菌種分布、流行狀況及趨勢，為 NTM肺病的疫情監(jiān)測及制定防控策略提供科學(xué)依據(jù)，以適應(yīng)臨床診治工作的需要。

材料和方法

一、研究對象

收集2012—2017年來自湖南省14個地級市、經(jīng)湖南省胸科醫(yī)院行BACTEC MGIT 960 法確診為分枝桿菌感染的患者15 576例，其中男性11 126例，女性4450例。分離出分枝桿菌菌株15 576株(每例患者1株)。H37RV標(biāo)準(zhǔn)菌株來源于中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病控制中心國家結(jié)核病參比實驗室。

二、試劑與儀器

4%NaOH、pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)按照《結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程》[4]的規(guī)程由科室自配；BACTEC MGIT 960分枝桿菌分析系統(tǒng)(簡稱MGIT 960)及其配套試劑MGIT 試管(含7H9 液體培基)、油酸-白蛋白-右旋糖-過氧化氫酶(OADC)添加劑(含營養(yǎng)液)、雜菌抑制劑購自美國 BD公司；萋-尼抗酸染色試劑、改良羅氏培養(yǎng)基、PNB培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒(MPB64蛋白免疫膠體金法)購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司。采用16S rRNA和Hsp65兩個同源序列分析及斑點雜交方法將NTM鑒定到種水平，引物合成及測序由北京瑞博生物有限公司完成，所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

三、研究方法

(一)MGIT 960分離培養(yǎng)

培養(yǎng)按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[6]進行，儀器報陽培養(yǎng)標(biāo)本進行萋-尼抗酸涂片染色，抗酸染色陽性報告“分枝桿菌培養(yǎng)陽性”。

(二)MTBC與NTM初步鑒定

1.MPB64蛋白免疫膠體金法：MGIT 960 系統(tǒng)分離培養(yǎng)的陽性菌株直接應(yīng)用其液體培養(yǎng)基上清液進行檢測。吸取上述待測菌液 0.1 ml 加入試劑檢測板上的加樣孔，15～60 min觀察檢測結(jié)果。檢測線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紫紅色條帶，判定為陽性；檢測線未出現(xiàn)紫紅色條帶，質(zhì)控線出現(xiàn)弱紫紅色條帶，判定為疑似陽性；檢測線未出現(xiàn)紫紅色條帶，質(zhì)控線出現(xiàn)紫紅色條帶，判定為陰性；檢測線和質(zhì)控線雙方均未出現(xiàn)紫紅色條帶，判定為無效。

2. PNB生長試驗：取100 μl經(jīng)MPB64蛋白免疫膠體金法鑒定為陰性的MGIT 960 系統(tǒng)分離培養(yǎng)陽性菌液，接種于改良羅氏培養(yǎng)基和PNB培養(yǎng)基生長管內(nèi)，置入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。改良羅氏培養(yǎng)基有分枝桿菌生長、PNB培養(yǎng)基無分枝桿菌生長為MTBC；改良羅氏培養(yǎng)基與PNB培養(yǎng)基均有分枝桿菌生長為NTM。

(三)NTM菌種鑒定

由于實驗室條件有限，且部分菌株丟失，對初步鑒定為NTM的菌株全部開展菌種鑒定工作始于2016年，具體操作步驟如下：

1．細菌DNA的制備：用接種環(huán)取改良羅氏培養(yǎng)基上生長的分枝桿菌1～2環(huán)菌落，溶于500 μl生理鹽水中，85 ℃滅活20 min；離心半徑8.5 cm，12 000 r/min 離心5 min，棄上清，菌體沉淀用500 μl 無菌純水中重懸洗滌；然后離心半徑8.5 cm，12 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入50 μl無菌純水，95 ℃ 金屬浴10 min，之后超聲處理15 min。離心半徑8.5 cm，12 000 r/min 離心5 min，取上清備用(-20 ℃ 冷凍保存)。

2. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及分子測序技術(shù)：采用16S rRNA、Hsp65兩對引物擴增，16S rRNA上游引物為：5′-CACATGCAAGTCGAACGGAAA-GG-3′；下游引物為5′-GCCCGTA-TCGCCCGCACGCT-3′。Hsp65上游引物: 5′ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′，下游引物: 5′-CTTGTC-GAACCGCATACCCT-3′，由北京瑞博生物有限公司合成。16S rRNA產(chǎn)物800 bp, Hsp65產(chǎn)物400 bp；PCR反應(yīng)體系 50 μl：上游、下游引物各 1.5 μl，2×Taq PCR Master Mix 25 μl，ddH2O 20 μl，DNA 2 μl，同時取兩管PCR反應(yīng)管分別加入結(jié)核分枝桿菌陽性質(zhì)控品和結(jié)核分枝桿菌陰性質(zhì)控品。按如下程序擴增：預(yù)變性95 ℃ 5 min，1個循環(huán); 變性94 ℃ 35 s，退火60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35個循環(huán)；延伸72 ℃ 8 min，1個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳40 min，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描攝影，條帶需明亮單一，否則進一步純化。PCR擴增產(chǎn)物送北京瑞博生物有限公司進行測序，利用生物數(shù)據(jù)分析軟件(BLAST)將測序得到的基因序列與美國國立生物技術(shù)信息中心 (NCBI)網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)做同源性比較，相似度≥97%即可確定菌種。

3. 斑點雜交技術(shù)：測序失敗菌株則應(yīng)用亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司研制的分枝桿菌菌種鑒定基因檢測試劑盒進行檢測, 檢測方法為斑點雜交法，具體操作步驟參照說明書。

結(jié) 果

一、NTM的分離情況

分離培養(yǎng)出15 576株分枝桿菌菌株中，MPB 64抗原檢測陽性13 550株、陰性2026株，經(jīng)PNB生長試驗鑒定后，MPB64抗原陰性標(biāo)本中鑒定出NTM 1584株、MTBC 442株。2012—2017年NTM檢出率見表1。

二、 NTM感染者性別、年齡、職業(yè)分布

2012—2017年湖南省14個地級市NTM感染者中，男性占62.06%(983/1584)，女性占37.94%(601/1584)，且各年NTM感染者均為男性多于女性；各年齡組NTM感染者分布顯示，40～歲的中老年患者為感染高峰人群(39.02%，618/1584)；各類職業(yè)分布顯示，NTM感染者均以農(nóng)民為主(66.67%，1056/1584)，見表2。

表1 2012—2017年湖南省14個地級市NTM檢出情況

三、NTM菌種分布特征

2016年共鑒定出333株NTM及3例MTBC與NTM混合感染。333株NTM菌種分布達 24種，菌種分布位列前4者分別為胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、戈登分枝桿菌、鳥分枝桿菌，分別占25.23%、24.62%、18.62%、16.82%(表3)。其他49株(14.71%)NTM，包含20種NTM，分別為偶發(fā)分枝桿菌9株，蟾蜍分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌各5株，緩黃分枝桿菌、新金分枝桿菌各4株，外來分枝桿菌、三重分枝桿菌各3株，馬賽分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌各2株，另10種分枝桿菌各1株。3例混合感染者，分別為結(jié)核分枝桿菌+膿腫分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌+胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌+蟾蜍分枝桿菌。

2017年NTM菌種共有383株，包括21種類型，菌種分布位列前4者仍然為胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、戈登分枝桿菌，鳥分枝桿菌，分別占27.15%，22.46%，21.15%，17.49%(表3)。其他45株(11.75%)NTM，包含17種NTM，分別為偶發(fā)分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌各8株，瘰疬分枝桿菌6株，堪薩斯分枝桿菌、馬賽分枝桿菌、塞內(nèi)加爾分枝桿菌各3株，摩納哥分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、新金分枝桿菌各2株，另8種分枝桿菌各1株。

討 論

NTM廣泛存在于水、土壤、灰塵等自然環(huán)境中，其中部分為致病菌或條件致病菌，目前NTM肺病的發(fā)病率及流行率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[7]。由于NTM肺病無傳染性，大多數(shù)國家并不強制報告，因此監(jiān)測數(shù)據(jù)不僅有限且不可靠[8]。陳闖等[9]通過中國知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)庫檢索的2010年前后NTM感染相關(guān)論文得出，除了浙江省、廣東省的 NTM 檢出率高于 20%外，其他地區(qū)的NTM檢出率均低于20%；其中上海市、陜西省、河北省、四川省的 NTM 檢出率雖處于較高水平，但也僅在 10%左右，而山東省、云南省、西藏、新疆、河南省、湖北省，以及哈爾濱市和吉林市等東北地區(qū)報告的 NTM 檢出率僅為5%左右。本研究統(tǒng)計結(jié)果顯示，近6年湖南省14個地級市NTM檢出率為10.17%，處在全國較高水平。

表2 NTM感染者不同特征在2012—2017年的分布情況

表3 NTM不同菌種類型在2016—2017年中的分布情況

近年來，NTM 的臨床實驗室檢出率有所增加，這與現(xiàn)代細菌學(xué)方法的快速鑒別診斷密切相關(guān)。隨著免疫檢測技術(shù)和分子生物技術(shù)的發(fā)展，NTM的鑒定技術(shù)也取得很大的進步。但目前我國對NTM的診斷沒有建立早期、快速、敏感和特異的標(biāo)準(zhǔn)化診斷技術(shù)[8]。傳統(tǒng)PNB生長試驗鑒別MTBC與NTM的能力較強，但耗時較長，且不能將NTM鑒定到種水平[4]。MPB64 蛋白免疫膠體金法的檢測原理是利用MPB64抗原是MTBC在液體培養(yǎng)基中生長時主要的分泌蛋白之一，NTM在培養(yǎng)濾液中多不存在此分泌蛋白，由此將MTBC與NTM進行初步的菌種鑒定[5]。MPB64蛋白免疫膠體金法操作簡單、用時短、不需特殊設(shè)備，但也存在部分結(jié)核分枝桿菌不分泌MPB64蛋白，因此有部分MTBC的MPB64抗原檢測呈陰性[10]。本研究采用MPB64蛋白免疫膠體金法將分枝桿菌快速鑒別出大部分MTBC，同時應(yīng)用PNB生長試驗鑒定出NTM及少部分MPB64抗原呈陰性的MTBC。本研究在進行分枝桿菌初步鑒定時采用MPB64蛋白免疫膠體金法與PNB生長試驗兩種方法結(jié)合，既節(jié)省了大部分分枝桿菌的初步鑒定時間，又防止部分MPB64呈陰性的MTBC被誤診為NTM。2013年之前我院對MGIT 960培養(yǎng)陽性培養(yǎng)物主要靠抗酸染色涂片，存在部分NTM被誤診為MTBC的情況；采用MPB64蛋白免疫膠體金法與PNB生長試驗兩種方法對菌株進行初步鑒定可以減少誤診和漏診。

本研究發(fā)現(xiàn)2012—2017年NTM感染者均以男性為主，這與羅春明等[11]和楊栗坤等[12]的研究結(jié)果一致。另外，2012—2017年間NTM感染患者主要為>40歲的中老年農(nóng)民，出現(xiàn)這種情況的原因可能為NTM 廣泛存在于自然界，人與某些動物均可從環(huán)境中感染NTM而致病，水和土壤是重要的傳播途徑[3]。有文獻報道表明，感染NTM的危險因素與男性吸煙、人口老齡化、免疫抑制人群增多及環(huán)境暴露等因素有關(guān)[13]。

本研究依據(jù)《結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程》[4]、應(yīng)用16S rRNA、Hsp65測序法進行菌種鑒定?？紤]到部分測序結(jié)果出現(xiàn)雙峰，有可能存在混合感染現(xiàn)象[14]，故采用斑點雜交法再次檢測出現(xiàn)雙峰的標(biāo)本。2016、2017年菌種鑒定結(jié)果顯示，菌種分布達 24種，位列前4者分別為：胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、戈登分枝桿菌，鳥分枝桿菌，這與我院2011年的分析數(shù)據(jù)[15]及福建省[16]、浙江省[17]的菌種分布類似。同時采用斑點雜交法鑒定出3例混合感染，為臨床難治性混合感染患者的進一步治療提供了可靠的實驗室依據(jù)。段鴻飛[18]研究認為胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌為致病菌,分離出戈登分枝桿菌有可能是患者標(biāo)本被NTM污染且并不致病。因此，對于湖南省14個市檢出的戈登分枝桿菌是否為標(biāo)本污染菌、是否導(dǎo)致疾病，還需做進一步的深入研究。

筆者單位作為全省的結(jié)核病防治定點?？漆t(yī)院，具有來自全省14個地級市的大樣本，且初步總結(jié)了近6年內(nèi)NTM的檢出率、易感人群，以及近2年的NTM菌種分布特征，因此本研究可為了解湖南省NTM的感染現(xiàn)狀提供一定的參考依據(jù)。但本研究也存在一定的局限性，由于受當(dāng)時實驗人員不熟悉菌種測序工作及菌株未保存完整等實驗條件的限制，我院只在2016年之后將全部NTM菌株鑒定到種水平。因此，為更好地做好NTM感染的防治工作，還需繼續(xù)監(jiān)測湖南省NTM感染的菌種分布情況。