鄭立恒 柳曉金 馮建純 章志華 何紅彥 邵艷新 陳顏強(qiáng)

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是最嚴(yán)重的肺外結(jié)核，占所有結(jié)核病的0.5%～1.0%[1]，病死率可達(dá)26.8%[2]，生存者中20%～30%有永久性后遺癥[3]。在臨床診治中，由于患者臨床表現(xiàn)缺乏特異性，病原學(xué)陽性檢出率極低[4]，誤診誤治、延誤治療的情況常見[5]。TBM患者的預(yù)后依賴于早期快速診斷，所以尋找早期快速準(zhǔn)確的診斷方法一直是臨床上亟待解決的問題[6]。2012年Chen等[7]應(yīng)用改良抗酸染色法對(duì)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的診斷是里程碑性的變革，但是操作比較繁瑣；本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步將操作流程進(jìn)行簡(jiǎn)化。2010年，WHO推薦將GeneXpert MTB/RIF技術(shù)(簡(jiǎn)稱“GeneXpert技術(shù)”)作為肺結(jié)核首選篩查方法，然而其對(duì)TBM的診斷價(jià)值尚不明確，未見大樣本的相關(guān)研究[8]。為此，對(duì)河北省胸科醫(yī)院和石家莊市第五醫(yī)院收治并臨床確診的45例TBM患者和42例非TBM患者的腦脊液同時(shí)進(jìn)行離心涂片抗酸染色、改良抗酸染色法和GeneXpert技術(shù)檢測(cè)，并對(duì)這3種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，為臨床診斷提供相關(guān)數(shù)據(jù)，以指導(dǎo)臨床選擇實(shí)用、有效的檢測(cè)方法。

資料和方法

一、臨床資料

搜集2016年8月至2018年6月河北省胸科醫(yī)院和石家莊市第五醫(yī)院收治并臨床確診的45例TBM及42例非TBM患者，其中，男61例、女26例，年齡18～81歲，平均年齡(36.2±9.7)歲。

按照最新的TBM診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，根據(jù)臨床表現(xiàn)、頭顱影像學(xué)、腦脊液及腦外結(jié)核灶的證據(jù)進(jìn)行評(píng)分，將患者分為以下4類：(1)確診的TBM：符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)腦脊液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性或檢出抗酸桿菌或核酸檢測(cè)陽性；(2)很可能的TBM：符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)評(píng)分≥10分(沒有神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)表現(xiàn))或臨床評(píng)分≥12分(有神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)表現(xiàn))，且腦脊液或神經(jīng)影像學(xué)評(píng)分≥2分，同時(shí)排除其他類型腦膜炎；(3)可能的TBM：符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，且臨床評(píng)分為6～9分(沒有神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)表現(xiàn))或臨床評(píng)分為9～11分(有神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)表現(xiàn))，而未行腦脊液檢查或頭顱影像學(xué)檢查的不能確定診斷；(4)非TBM：不符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，未進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療，排除了TBM的其他確定性診斷。

按照上述標(biāo)準(zhǔn)，臨床診斷為TBM患者共計(jì)45例(為“確診的TBM+很可能的TBM”)、非TBM患者共計(jì)42例；非TBM組患者中包括隱球菌性腦膜炎10例、病毒性腦膜炎27例、腦出血5例。

二、儀器與試劑

二級(jí)生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，抗酸染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，顯微鏡(日本Olympus公司產(chǎn)品)，Cytospin-4型細(xì)胞離心沉淀儀(英國(guó)Thermo公司產(chǎn)品)，GeneXpert MTB/RIF儀器及配套試劑(美國(guó)Cepheid 公司產(chǎn)品)。

三、研究方法

1. 標(biāo)本留取：所有患者在用藥前進(jìn)行腰椎穿刺術(shù)，留取腦脊液5～10 ml，同時(shí)采用離心涂片抗酸染色法、改良抗酸染色法、GeneXpert技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

2. 離心涂片抗酸染色檢測(cè)：將腦脊液2～4 ml加入至無菌一次性試管中，采用1360×g離心10 min，輕輕吸出上清液棄掉，反復(fù)吹打試管底部沉渣進(jìn)行涂片，涂片面積1 cm×2 cm，然后按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[9]進(jìn)行抗酸染色及油鏡鏡檢。

3. 改良抗酸染色檢測(cè)：腦脊液充分混勻，取0.5 ml 加入Cytospin-4型細(xì)胞玻片離心沉淀儀中，采用28×g離心5～8 min；然后取出沉淀均勻涂在玻片上，待自然干燥后直接進(jìn)行抗酸染色及鏡檢。

4. GeneXpert技術(shù)檢測(cè)：腦脊液充分混勻后直接取2 ml加入反應(yīng)盒中，然后插入檢測(cè)平臺(tái)，輸入患者和標(biāo)本相關(guān)信息后開始運(yùn)行。儀器會(huì)自動(dòng)檢測(cè)熒光信號(hào)，結(jié)果判定依據(jù)循環(huán)閾值(Ct值)的高(Ct≤16)、中(1628)的標(biāo)準(zhǔn)[10]，判斷為MTB高含量、中含量、低含量、極低含量，2 h后自動(dòng)報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。率的比較采用χ2檢驗(yàn)、校正χ2檢驗(yàn)，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，離心涂片抗酸染色法、改良抗酸染色法、GeneXpert技術(shù)檢測(cè)87例患者腦脊液診斷TBM的敏感度分別為4.44%(2/45)、88.89%(40/45)、35.56%(16/45)，特異度均為100.00%；改良抗酸染色法與離心涂片抗酸染色法的敏感度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=64.46，P=0.000)；改良抗酸染色法與GeneXpert技術(shù)敏感度相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.23，P=0.000)；GeneXpert技術(shù)與離心涂片抗酸染色法敏感度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.16，P=0.000)；改良抗酸染色檢測(cè)分枝桿菌陽性預(yù)測(cè)值為100.00%，陰性預(yù)測(cè)值為89.36%(表1)。

討 論

TBM是由MTB引起的非化膿性炎性反應(yīng)，是結(jié)核病患者死亡的主要原因之一[11]。TBM的診斷多數(shù)為通過臨床表現(xiàn)、腦脊液常規(guī)生化檢測(cè)、頭顱影像學(xué)及是否有顱外結(jié)核病灶等綜合分析后做出的臨床診斷，極少能夠找到病原學(xué)證據(jù)，誤診情況常見，有文獻(xiàn)報(bào)道誤診率可高達(dá)50.73%[12]。其主要原因是長(zhǎng)期以來TBM病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)的瓶頸問題難以突破，但是TBM的早期診斷、規(guī)范治療是顯著改善患者預(yù)后、降低致殘率及致死率的關(guān)鍵[13]。

2009年全球41位專家在南非開普敦提出TBM診斷專家共識(shí)[8]，指出確診TBM除了符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)應(yīng)具備符合以下一項(xiàng)或多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)：(1)腦脊液中查到抗酸桿菌；(2)腦脊液MTB培養(yǎng)陽性；(3)腦脊液MTB核酸檢測(cè)陽性；(4)腦組織或脊髓中發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌或結(jié)核性病理改變[8]。由于顱腦是重要神經(jīng)中樞，不會(huì)輕易進(jìn)行腦組織及脊髓活檢，在臨床工作中極少行該方面的檢查。確診TBM目前多采用抗酸染色、MTB培養(yǎng)和分子學(xué)檢測(cè)。腦脊液離心涂片抗酸染色檢測(cè)的敏感度極低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道的其他檢測(cè)技術(shù)的敏感度；MTB培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng)、陽性率低，不能做到及時(shí)診斷；普通的PCR技術(shù)特異度差，假陰性和假陽性問題一直無法解決。因此，TBM的早期及時(shí)診斷極為困難[14]。研究與開發(fā)特異度和敏感度高并適合臨床推廣的早期TBM診斷方法是一個(gè)迫在眉睫的問題。

表1 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)3種技術(shù)對(duì)87例患者腦脊液檢測(cè)診斷TBM的效能比較

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

離心涂片抗酸染色法已經(jīng)應(yīng)用了很多年，雖然簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)，但是檢出分枝桿菌的陽性率極低，不能滿足臨床需要。其主要原因是：(1)腦脊液所處位置特殊，決定了其中的MTB的荷菌量極低，但是普通抗酸染色檢測(cè)陽性則要求腦脊液的荷菌量達(dá)到5000～10 000條/ml，故陽性率不可能太高；(2)腦脊液每次取出的量是有限的，不可能一次性進(jìn)行大量的采集，所以可以收集到的菌量很少，增加標(biāo)本量可以提高陽性率，但是不可行；(3)MTB的比重小于腦脊液的比重，離心時(shí)受到浮力的作用，不易完全沉到管底，棄掉上清時(shí)可造成細(xì)菌的丟失；(4)離心后轉(zhuǎn)移涂片時(shí)本來菌量很少的細(xì)菌不可能完全轉(zhuǎn)移出來，使陽性率進(jìn)一步降低；(5)抗酸染色涂片面積為1 cm×2 cm，顯微鏡下大約有10 000個(gè)視野，但是閱片只看300個(gè)視野，大部分觀察面積被遺漏，亦會(huì)降低陽性率。文獻(xiàn)報(bào)道腦脊液離心涂片抗酸染色法檢測(cè)的陽性率在10%左右[15-16]，本研究TBM組中離心涂片抗酸染色法檢測(cè)抗酸桿菌的檢出率為4.44%，較文獻(xiàn)報(bào)道偏低。

2012年，改良抗酸染色法的應(yīng)用是一個(gè)里程碑式的進(jìn)步，此法應(yīng)用細(xì)胞玻片離心沉淀儀濃集腦脊液白細(xì)胞和病原菌后再進(jìn)行抗酸染色。研究結(jié)果顯示，腦脊液標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)陽性患者采用改良抗酸染色法的抗酸桿菌檢出率為100.00%，其中大多數(shù)標(biāo)本可檢出細(xì)胞內(nèi)的抗酸桿菌[7]。文獻(xiàn)研究表明，改良抗酸染色法檢測(cè)陽性率高的原因是：(1)用 4%多聚賴氨酸固定玻片15 min，有利于MTB黏附在玻片上，在染色過程中可減少細(xì)菌的丟失；(2)制片后用固定液固定15 min，有利于保持細(xì)胞的正常形態(tài)，便于觀察被吞噬的MTB；(3)0.3%的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)浸泡30 min以破壞白細(xì)胞胞膜，有利于對(duì)被吞噬的MTB染色。

本研究應(yīng)用改良抗酸染色法后陽性率明顯提高，但過程耗時(shí)耗力，檢測(cè)一個(gè)標(biāo)本需要將近2 h。工作中發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌基本都在細(xì)胞外，故簡(jiǎn)化步驟為利用玻片離心沉淀儀濃集細(xì)胞和分枝桿菌后直接進(jìn)行抗酸染色，節(jié)省了固定和破膜的45 min，比傳統(tǒng)的離心涂片抗酸染色更節(jié)省時(shí)間，效果更好。陽性率高的原因?yàn)椋?1)離心過程中腦脊液被濾紙吸收，不存在離心時(shí)浮力的問題；(2)有形成分直接沉淀到玻片上，不存在轉(zhuǎn)移損失問題；(3)沉淀面積很小，病原菌得到了高度濃集；(4)較發(fā)表的改良抗酸染色法[7]處理步驟更少，進(jìn)一步減少了病原菌的丟失。簡(jiǎn)化后的改良抗酸染色法TBM組檢出率(88.89%)明顯高于離心涂片抗酸染色(4.44%)和GeneXpert技術(shù)(35.56%)。

GeneXpert技術(shù)是半巢氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，可對(duì)MTB進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為131菌落形成單位(CFU)/ml[17]，其為結(jié)核病的早期診斷提供了高效的確診方法；為WHO推薦使用的用于MTB及利福平耐藥快速檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、快速、敏感度高、特異度強(qiáng)等特點(diǎn)[18-19]。自應(yīng)用以來得到了肺結(jié)核及耐藥肺結(jié)核診斷領(lǐng)域?qū)＜业膹V泛認(rèn)可，但其對(duì)肺外結(jié)核的研究相對(duì)較少，診斷價(jià)值還待進(jìn)一步研究。相關(guān)研究的Meta分析顯示，此技術(shù)在肺外結(jié)核診斷中的敏感度為25%～96%左右，特異度幾乎為100%；但是其對(duì)腦脊液、胸腹腔積液、關(guān)節(jié)液、心包積液等不同標(biāo)本的敏感度有較高的異質(zhì)性，需要進(jìn)行更為深入的研究[20-21]。本研究采用GeneXpert技術(shù)檢測(cè)臨床確診為TBM患者的腦脊液，MTB的陽性檢出率(35.56%)高于離心涂片抗酸染色法(4.44%)對(duì)分枝桿菌的檢出率，高于鄒月麗等[22]報(bào)道確診MTB組的23.68%。其原因可能是：(1)本研究入選TBM患者時(shí)標(biāo)準(zhǔn)非常嚴(yán)格；(2)操作步驟不是按照痰液等標(biāo)本那樣還需加入消化液，這樣會(huì)稀釋腦脊液中荷菌量本來就很低的MTB，因?yàn)槟X脊液里面蛋白含量低，沒有可見凝塊，本研究直接取混勻的2 ml腦脊液加入反應(yīng)盒中進(jìn)行檢測(cè)。

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，本研究3種檢測(cè)方法的特異度均為100.00%，改良抗酸染色和GeneXpert技術(shù)檢測(cè)TBM的敏感度較高，其原因可能是：(1)本研究樣本量(僅87例)較少；(2)操作人員受到嚴(yán)格的訓(xùn)練，操作規(guī)范，形態(tài)學(xué)識(shí)別能力強(qiáng)；(3)研究組多年從事TBM研究，入組患者選擇比較嚴(yán)格。以后還要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，離心涂片抗酸染色法檢測(cè)患者腦脊液的陽性率極低，對(duì)TBM的早期診斷意義不大。進(jìn)一步簡(jiǎn)化的改良抗酸染色法明顯提高了TBM患者腦脊液中分枝桿菌的檢出率；但是很多單位對(duì)此技術(shù)還不了解，在許多省份中還是空白。改良抗酸染色法操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)室條件要求相對(duì)較低，亟待推廣使用，其缺點(diǎn)是不能區(qū)分抗酸桿菌是結(jié)核還是非結(jié)核分枝桿菌。GeneXpert技術(shù)是個(gè)有益的補(bǔ)充，但該技術(shù)要求標(biāo)本的荷菌量達(dá)到100～200條/ml，其雖然沒有改良抗酸染色法敏感度高，但是可以區(qū)分結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌。