詹明君，益西措姆，扎西央宗，劉斌云，巴桑央吉

自身抗體作為自身免疫性疾病(antoimmune diseases,AID)的特征性標(biāo)志，在AID的診療中具有廣泛的臨床意義?？购丝贵w(anti-nuclear antibodies,ANA)屬自身抗體中的一組抗體，對(duì)自身免疫性疾病的診斷、鑒別診斷意義重大。間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence,IIF)可檢測ANA，被認(rèn)為是ANA檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，該方法檢測敏感度高、成本低廉，常作為ANA檢測的篩選實(shí)驗(yàn)，是自身免疫實(shí)驗(yàn)室的基本項(xiàng)目之一?？购丝贵w譜(anti-nuclear antibody spectra,ANAs)是一組特異性抗體，目前國內(nèi)主要的檢測方式為線性免疫印跡(linear immunoblotting,LIA)、化學(xué)發(fā)光、蛋白芯片等。

西藏地處高寒地帶，由于人員、設(shè)備、成本、疾病分布特點(diǎn)、地大人稀以及臨床對(duì)自身免疫性疾病認(rèn)識(shí)不足、風(fēng)濕免疫專科建設(shè)緩慢等各種因素的影響，西藏開展抗核抗體檢測時(shí)間較晚。 臨床實(shí)踐中，因成本、人員、質(zhì)量等諸多因素影響，部分實(shí)驗(yàn)室僅開展ANA檢測；部分實(shí)驗(yàn)室直接采用化學(xué)發(fā)光等自動(dòng)化儀器檢測ANAs；部分臨床醫(yī)生先申請ANA檢測，結(jié)果出來后再申請ANAs檢測等。近年來，自身免疫性疾病實(shí)驗(yàn)室檢測項(xiàng)目、檢測方法越來越多，本研究通過比較IIF檢測ANA和LIA檢測ANAs，分析這2種方法檢測ANA在西藏地區(qū)的臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2018年1月至12月西藏自治區(qū)人民醫(yī)院送檢血清標(biāo)本2 481例，其中男性1059例，年齡1～96歲，平均年齡47歲，女性1 422例，年齡1～89歲，平均年齡46歲；藏族2 363例，漢族112例，回族4例，蒙古族1例，白族1例。臨床診斷系統(tǒng)性AID患者522例，其中藏族505例，漢族16例，回族1例；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)256例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)167例，干燥綜合征(SS)81例，結(jié)締組織病(CTD)27例，肌炎/皮肌炎(PM/DM)8例，系統(tǒng)性硬化征(SSc)10例，抗磷脂綜合征(APS)10例，系統(tǒng)性血管炎2例，重疊綜合征19例。

1.2 標(biāo)本采集和處理

抽取清晨空腹靜脈血，3 500 r/min離心15 min，同時(shí)采用IIF法測定ANA和LIA法檢測ANA譜17項(xiàng)，不能及時(shí)檢測標(biāo)本，使用凍存管分裝后-20 ℃保存。

1.3 IIF法檢測ANA

使用歐蒙公司提供的抗核抗體IgG檢測(IIF)試劑盒，采用HEp-2細(xì)胞和猴肝抗原片，血清采用歐蒙推薦稀釋方案稀釋后與抗原基質(zhì)片反應(yīng)30 min后沖洗，并浸泡5 min，加入熒光二抗(IgG)避免陽光直射孵育30 min后沖洗，并浸泡5 min，封片后熒光顯微鏡下判讀結(jié)果，以抗體滴度≥1∶100為陽性。

1.4 LIA法檢測ANAs

使用亞輝龍公司提供的抗核抗體譜17項(xiàng)檢測(LIA)試劑盒，采用Tenfly Blot-B蛋白印跡儀檢測ANAs特異性抗體，包括抗核小體、抗組蛋白、抗SmD1、抗PCNA、抗P0、抗SSA/Ro60 KD，抗SSA/Ro52 KD，抗SSB/La、抗著絲點(diǎn)蛋白B、抗Scl-70、抗U1-snRNP、抗AMA-M2、抗Jo-1、抗PM-Scl、抗Mi-2、抗Ku抗體及抗ds-DNA 17項(xiàng)抗體。將膜條放入孵育盤內(nèi)，使用孵育緩沖液浸濕膜條后移去液體，加入孵育緩沖液，樣本10 μl血清(1∶100稀釋)與膜條上的靶抗原孵育30 min，移去液體并洗滌3次，加入酶聯(lián)物孵育30 min，移去液體并洗滌3次，加入底物，避光孵育10 min，移去底物用蒸餾水洗滌，加入終止液孵育5 min，移去終止液，吸干膜條殘留液體，使用判讀卡判讀結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，IIF與LIA檢測結(jié)果符合率的比較，采用χ2檢驗(yàn)。兩種方法檢測結(jié)果一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANA與ANAs檢測結(jié)果符合率

2 481例患者中，IIF法檢測ANA與LIA法檢測ANAs結(jié)果的總體符合率為80.57%。其中兩種方法檢測均陽性患者350例，占14.11%；僅IIF(+)ANA患者421例，占16.97%；僅LIA(+)ANAs患者61例，占2.46%；兩種方法檢測均陰性1 649例，占66.47%。

771例IIF(+)ANA患者中350例LIA(+)ANAs，兩種方法檢測結(jié)果符合率為45.40%；1 710例IIF(-)ANA患者中1 649例LIA(-)ANA，檢測結(jié)果符合率為96.43%；411例LIA(+)ANAs患者中350例IIF(+)ANAs，檢測結(jié)果符合率為85.16%，2 070例LIA(-)ANAs患者中1 649例IIF(-)ANA,檢測結(jié)果符合率為79.66%。

兩種方法學(xué)結(jié)果比較，χ2=672.677，P<0.01；Spearman分析，r=0.521，P<0.01；一致性分析，Kappa=0.480，P<0.01。

2.2 不同稀釋滴度IIF(+)標(biāo)本LIA檢測結(jié)果

IIF(+)LIA(-)組滴度以1∶100為主，占70.31%，高于IIF(+)LIA(+)組(31.42%，χ2=115.89，P<0.01)；而IIF(+)LIA(+)組滴度以1∶320～1∶1 000為主，占50.57%，高于IIF(+)LIA(-)組(27.08%，χ2=44.89，P<0.01)；IIF法檢測結(jié)果滴度≥1∶3 200組，LIA(+)組為18.00%，高于LIA(-)組(2.61%，χ2=52.15，P<0.01)(表1)。

表1 不同稀釋滴度IIF(+)標(biāo)本LIA檢測結(jié)果Table 1 LIA-ANAs results of IIF(+)ANA specimens with different dilution[n(%)]

2.3 IIF(-)LIA(+)與RA、SLE、SS的關(guān)系

本研究人群以RA、SLE、SS為主要AID。IIF(-)LIA(+)61例，其中RA患者8例，SLE患者5例，疑似SS患者1例，其他47例。IIF(-)LIA(+)患者表現(xiàn)為多種靶抗原陽性，SSA/Ro60、SSA/Ro52、SSB/La、U1-snRNP陽性率分別為27.87%，24.59%，21.31%，11.48%(表2)。

表2 IIF(-)LIA(+)RA、SLE者特異性 抗體檢測結(jié)果Table 2 Specific antibodies results of IIF(-)LIA(+) group in RA and SLE patients

2.4 IIF(+)LIA(+)及IIF(-)LIA(-)與RA、SLE、SS的關(guān)系

2 481例標(biāo)本中，IIF(+)LIA(+)350例，其中RA 50例，占14.29%；SLE 126例，占36.00%；SS 65例，占18.57%。IIF(-)LIA(-)1 649例，其中RA 98例，占5.94%；SLE 12例，占0.73%；SS 4例，占0.24%。IIF(+)LIA(+)及IIF(-)LIA(-)與RA、SLE、SS關(guān)系比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。χ2分別為29.31、558.91和291.05，均P=0.00。

3 討論

AID實(shí)驗(yàn)室檢測方法近幾十年迎來了高速發(fā)展的時(shí)代，隨著自身抗體不斷的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)，AID越來越多的自身抗體譜被大家熟知和應(yīng)用于臨床，IIF檢測抗核抗體和某些疾病特異性抗體被用于AID的診斷指南，所以實(shí)驗(yàn)室開展AID相關(guān)抗體檢測非常重要。

以Hep-2細(xì)胞為抗原基質(zhì)的IIF法檢測ANA雖然不具有疾病特異性，但由于其抗原種類豐富、敏感性高、易于觀察及熒光模型分型，被國內(nèi)外眾多實(shí)驗(yàn)室廣泛采用，并作為ANA檢測的篩選試驗(yàn)。IIF法檢測的ANA是針對(duì)整個(gè)細(xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期等成分的總抗體，并且可用于未知抗體的檢測，被認(rèn)為是檢測ANA的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]。

本研究對(duì)2481例樣本進(jìn)行分析，結(jié)果表明IIF檢測ANA和LIA檢測ANAs的總體符合率為80.57%，兩種方法的檢測一致性強(qiáng)度一般(P<0.01)，其中ANA(+)ANAs(-)樣本421例，占16.97%；ANA(-)ANAs(+)樣本61例，占2.46%。該結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)室如果僅選用IIF檢測ANA，存在一定的漏檢率；而實(shí)驗(yàn)室如果僅選用LIA檢測ANAs，存在更大的漏檢率，與國內(nèi)其他地區(qū)研究結(jié)果[2]類似。但本研究兩種方法學(xué)陰性符合率高于其他研究報(bào)道，可能與研究選用的試劑有關(guān)，但由于累積數(shù)據(jù)不足不排除地區(qū)差異。

研究不同稀釋滴度ANA(+)標(biāo)本LIA檢測結(jié)果表明，IIF法初篩陽性標(biāo)本中，LIA法靶抗原陽性時(shí)IIF滴度以1∶320～1∶1 000為主，LIA法靶抗原陰性時(shí)IIF滴度以1∶100為主，占70.31%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

IIF(-)LIA(+)61份標(biāo)本分析結(jié)果表明，IIF檢測ANA雖然表現(xiàn)為抗原豐富、敏感度高，但仍可導(dǎo)致漏檢，數(shù)據(jù)顯示最容易漏檢的靶抗原依次為SSA/Ro60、SSA/Ro52、SSB/La、U1-snRNP、組蛋白、SmD1、AMA-M2、Scl-70、CENP-B、PM-Scl、Mi-2等，陽性率為4.92%～27.87%不等。該數(shù)據(jù)再一次證明實(shí)驗(yàn)室僅開展IIF檢測ANA，不開展LIA靶抗原檢測，存在一定漏檢，這些漏檢幾乎包括了所有種類的特異性抗體，如SSA/Ro52、SSA/Ro60、SSB/La、AMA-M2、U1-snRNP、SmD1、Scl-70、CENP-B、PM-Scl抗體，甚至某些抗體已納入某種AID的診斷指南。

研究IIF(+)LIA(+)及IIF(-)LIA(-)與RA、SLE、SS的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，本研究臨床診斷RA患者256例，IIF(+)LIA(+)患者50例(占19.53%)，IIF(-)LIA(-)患者98例(占38.28%)；SLE患者167例，IIF(+)LIA(+)患者126例(占75.45%)，IIF(-)LIA(-)患者12例(占7.19%)；SS患者81例，IIF(+)LIA(+)患者65例(占80.25%)，IIF(-)LIA(-)患者4例(占4.94%)。抗核抗體聯(lián)合抗核抗體譜檢測有效提高SLE、SS臨床檢出率，但RA需要聯(lián)合其他指標(biāo)進(jìn)行檢測，如RF或CCP等，另外IIF(+)LIA(+)仍然存在部分非AID患者。研究表明當(dāng)患者結(jié)果為IIF(-)LIA(-)時(shí)，患AID的可能性較小，可根據(jù)臨床表現(xiàn)區(qū)別處理，以免漏診、誤診。另外，患者有典型的AID臨床表現(xiàn)時(shí)，無論血清學(xué)檢測自身抗體是否陽性都應(yīng)長期隨訪，以免漏診、誤診。

綜上所述，IIF檢測ANA作為篩查試驗(yàn)，具有較高的敏感性和抗體豐富的特點(diǎn);LIA檢測ANAs具有較高的特異性，且受限于檢測時(shí)靶抗原種類，兩種方法為互補(bǔ)模式，不能相互替代，由于每種方法學(xué)均存在假陽性和假陰性[3]，且筆者所在地區(qū)未建立AID患者的陽性CUTOFF值，因此選用其中任何一種方法檢測都有可能造成漏檢、誤診。筆者建議對(duì)有能力有條件的疑似患者，臨床首診應(yīng)同時(shí)送檢ANA和ANAs，以減少漏診、誤診。

針對(duì)西藏地廣人稀的特點(diǎn)，IIF法檢測ANA，其操作簡單，成本低廉，可少量操作，對(duì)人員系統(tǒng)培訓(xùn)后可在基層醫(yī)院初步推廣，以用于AID的初步篩查。

目前AID診療指南關(guān)注ANA、特異性抗原的結(jié)果，也關(guān)注抗體的滴度、靶抗原的濃度。故實(shí)驗(yàn)室一方面應(yīng)同時(shí)開展ANA和ANAs的檢測；另一方面應(yīng)準(zhǔn)確報(bào)告ANA和ANAs的滴度和濃度結(jié)果，采用標(biāo)準(zhǔn)化一致的結(jié)果判讀和報(bào)告模式，以利于結(jié)果互認(rèn)，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

同時(shí)，對(duì)血清學(xué)檢測陰性的疑似患者應(yīng)長期隨訪，以防漏診，對(duì)高危人群(包括AID患者直系親屬、實(shí)驗(yàn)人員、高危環(huán)境等人群)應(yīng)定期隨訪，以期早發(fā)現(xiàn)早治療[4]。