曲范杰 張捷 時(shí)淑珍

[摘要]目的 探討比卡魯胺對(duì)人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響及其可能的機(jī)制。方法 0、25、50、100 μmol/L比卡魯胺處理人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的抑制率;流式細(xì)胞儀檢測(cè)比卡魯胺對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞作用后凋亡率及其細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果 不同濃度（25、50、100 μmol/L）比卡魯胺處理后，MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力明顯下降，且存在時(shí)間、劑量依賴關(guān)系。比卡魯胺可以明顯地增加細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期表現(xiàn)為G0/G1期阻滯（P<0.05）。結(jié)論 比卡魯胺可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞周期的機(jī)制從而對(duì)人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。

[關(guān)鍵詞]三陰性乳腺癌;比卡魯胺;MDA-MB-231;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R737.9 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1674-4721（2019）12（c）-0047-03

Effect of Bicalutamide on proliferation inhibition and induction apoptosis in triple negative breast cancer MDA-MB-231 cells

QU Fan-jie1 ? ZHANG Jie1 ? SHI Shu-zhen1 ? YUAN Xiao-lin2

1. Department of Oncology， the Third People′s Hospital of Dalian， Liaoning Province， Dalian ? 116033， China; 2. Central Laboratory， Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University， Liaoning Province， Dalian ? 116001， China

[Abstract] Objective To explore the effect of Bicalutamide on the proliferation of human triple negative breast cancer MDA-MB-231 cells and its potential molecular mechanism. Methods The human triple negative breast cancer MDA-MB-231 cells were treated with 0， 25， 50， 100 μmol/L Bicalutamide， MTT method was used to detect the inhibition rate of cells， and flow cytometry was performed to assay the effect of Bicalutamide on the apoptosis rate and cell cycle distribution of MDA-MB-231 cells. Results After treatment with different concentrations （25， 50， 100 μmol/L） of Bicalutamide， the proliferation ability of MDA-MB-231 cells significantly reduced， and there was a time-and dose-dependent relationship. Bicalutamide could significantly increase apoptosis of the MDA-MB-231 cells and induced the cycle arrest at G0/G1 phase （P<0.05）. Conclusion Bicalutamide can inhibit the proliferation of human triple negative breast cancer cells and potential molecular mechanism refers to cell apoptosis.

[Key words] Triple negative breast cancer; Bicalutamide; MDA-MB-231; Cell proliferation; Cell apoptosis

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一組具有特殊的生物學(xué)行為和臨床病理學(xué)特征的乳腺癌[1]，其特征是組織學(xué)分級(jí)高，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后較其他亞型的乳腺癌差，缺乏相應(yīng)的靶向治療[2]。TNBC的治療是目前臨床亟待解決的問題。為評(píng)價(jià)雄激素抑制劑比卡魯胺（Bicalutamide）用于TNBC臨床治療的可能性及可行性，本研究采用體外研究的方法探討了Bicalutamide對(duì)TNBC細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

人TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞、碘化丙啶（PI）由大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供;胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自杭州四季青公司;DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT ）試劑盒為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;比卡魯胺購(gòu)自阿斯利康公司;Annexin-V/PI雙染凋亡試劑盒為江蘇凱基公司產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀（BD Flow cytometers & Reagents）為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%滅活FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，并嚴(yán)格要求在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)呈70%～80%融合狀態(tài)時(shí)，再以0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。以上細(xì)胞生長(zhǎng)情況均在倒置顯微鏡下觀察，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為溶劑對(duì)照組和藥物干預(yù)組。比卡魯胺先由DMSO溶解并配成100 mmol/L 儲(chǔ)存液，-20℃避光保存。再以DMEM培養(yǎng)基將比卡魯胺儲(chǔ)存液稀釋到所需的濃度，使其中DMSO終濃度<0.1%。溶劑對(duì)照組即終濃度0.1%的DMSO，藥物干預(yù)組即比卡魯胺終濃度分別為25、50、100 μmol/L。

1.4細(xì)胞增殖抑制率的檢測(cè)

于96孔板中接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞為4×103孵育12 h后加入不同濃度比卡魯胺（0、25、50、100 μmol/L），每組6個(gè)復(fù)孔。分別于0、24、48、72 h采用MTT法，按照說明書操作檢測(cè)細(xì)胞活力，于酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔570 nm處吸光度（OD）值。每48 h更換培養(yǎng)液。

細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值）/對(duì)照組平均OD值×100%。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況及細(xì)胞凋亡情況

分別采用不同濃度的比卡魯胺（25、50、100 μmol/L）作用于MDA-MB-231細(xì)胞48 h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其誘導(dǎo)凋亡情況及細(xì)胞周期分布情況。于6 孔板中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞為4×103，待細(xì)胞貼壁后分別加入0、25、50、100 μmol/L 的比卡魯胺，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各孔的培養(yǎng)液到對(duì)應(yīng)的流式管中，1000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，冷PBS清洗2次，再次收集到對(duì)應(yīng)的流式管中，加入70%冰乙醇-20℃避光過夜。次日，再次離心并去乙醇，以預(yù)冷PBS洗滌后用含有終濃度20 mg/ml RNaseA酶的PI染液避光染色20 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用Multicycle System對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析。每組重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上數(shù)據(jù)比較用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1比卡魯胺對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

25、50、100 μmol/L比卡魯胺處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h細(xì)胞增殖抑制率分別為（29.45±1.23）、（32.38±1.93）、（45.31±4.23）%，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;干預(yù)48 h細(xì)胞增殖抑制率分別為（39.33±1.23）、（45.33±2.43）、（62.31±5.23）%，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;干預(yù)72 h細(xì)胞增殖抑制率分別為（46.13±2.63）、（53.93±3.13）、（74.31±5.28）%，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相同濃度組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞增值抑制率顯著提高（圖1）。提示比卡魯胺對(duì)TNBC細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，其抑制作用隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，且明顯與時(shí)間、劑量有關(guān)。

2.2比卡魯胺對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

隨著比卡魯胺濃度的增加，MDA-MB-231的細(xì)胞凋亡率明顯增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;比卡魯胺25、50、100 μmol/L各組的的細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），即隨著比卡魯胺濃度的增加，高濃度組較低濃度組細(xì)胞凋亡比例明顯增加。比卡魯胺作用48 h后，G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期比例降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;G2/M期細(xì)胞比例較對(duì)照組有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

3討論

有研究發(fā)現(xiàn)，雄激素受體（AR）與TNBC的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移以及預(yù)后有關(guān)，提示AR信號(hào)通路在TNBC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3-8]。已經(jīng)有更多的研究者注意到，雄激素及其受體信號(hào)通路是乳腺癌，尤其為HR-AR+亞型乳腺癌患者可能的治療靶點(diǎn)[9-12];通過抑制AR通路可能對(duì)TNBC治療有效。雄激素及其受體信號(hào)通路在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中承擔(dān)重要作用，比卡魯胺通過抑制AR的途徑被應(yīng)用于前列腺的臨床治療也取得了滿意的療效。近年來開展的臨床研究也發(fā)現(xiàn)，TNBC應(yīng)用AR抑制劑比卡魯胺等治療也可以獲得良好的臨床受益[13-17]。惡性增殖是腫瘤細(xì)胞的重要特征，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)雄激素抑制劑比卡魯胺用于TNBC的臨床治療的可能性及可行性，及探索其可能的機(jī)制，本研究采用體外研究的方法，應(yīng)用TNBC細(xì)胞株，觀察比卡魯胺對(duì)TNBC MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響。

本研究結(jié)果顯示，比卡魯胺對(duì)TNBC細(xì)胞的增殖有抑制作用。應(yīng)用不同濃度的比卡魯胺作用MDA-MB-231細(xì)胞24～72 h后，均可觀察到MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，其抑制作用隨著比卡魯胺濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，且明顯呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。

細(xì)胞增殖的抑制作用往往與細(xì)胞周期密不可分，目前，細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制越來越受到研究者的關(guān)注，干預(yù)及調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期從而阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)是目前腫瘤治療的重要策略。在細(xì)胞周期中，S期是DNA合成期，因此S期細(xì)胞比例下降常表明細(xì)胞的DNA合成下降，細(xì)胞的增殖受抑制。本研究采用不同濃度的比卡魯胺（25、50、100 μmol/L）作用于MDA-MB-231細(xì)胞48 h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其誘導(dǎo)凋亡情況及細(xì)胞周期分布情況，結(jié)果顯示，比卡魯胺作用后的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡比例明顯增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;比卡魯胺25、50、100 μmol/L各組的細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示比卡魯胺誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡呈濃度依賴關(guān)系。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，比卡魯胺作用48 h后，G0/G1期的細(xì)胞比例升高，S期的細(xì)胞比例降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;G2/M期細(xì)胞無(wú)明顯變化。提示比卡魯胺阻滯了TNBC細(xì)胞由G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化，并抑制DNA的合成，從而干預(yù)了MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，最終抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。

綜上所述，比卡魯胺明顯抑制TNBC MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，可能通過誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡發(fā)揮直接抗腫瘤作用，比卡魯胺對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)是其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制之一，這為比卡魯胺在TNBC的臨床應(yīng)用提供了更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2019-06-14 ?本文編輯：任秀蘭）