吳 澎，劉 娟，陳廣鳳，李向陽，趙子彤，楊 藝，唐曉珍，田紀(jì)春

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東 泰安 271018；2.德州學(xué)院生態(tài)與園林建筑學(xué)院，山東 德州 253023；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥品質(zhì)育種研究室，作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東 泰安 271018）

饅頭是深受我國人民尤其是北方人民喜愛的傳統(tǒng)主食，年消費量約占全國面制品的46%，在我國的飲食文化以及人們?nèi)粘Ｉ钪姓加兄匾牡匚籟1-2]。隨著當(dāng)前人們生活水平的逐漸提高，對面制品的要求已不僅是滿足飽腹，還要求具有良好的感官特性。因此，改良饅頭用面粉品質(zhì)對提高饅頭整體價值具有重要意義。但目前對于饅頭品質(zhì)的研究多傾向于復(fù)配粉、添加劑等加工條件方面[3-12]，未能從影響?zhàn)z頭品質(zhì)的內(nèi)部因素即原料小麥基因位點的多態(tài)性角度進(jìn)行研究。

全基因組關(guān)聯(lián)分析是指利用一定數(shù)量的標(biāo)記對所選材料的目標(biāo)性狀進(jìn)行性狀/標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)定位的分析方法。最初應(yīng)用于人類致病基因的研究[13-14]，Thornsberry等[15]首次將關(guān)聯(lián)分析技術(shù)引入進(jìn)植物領(lǐng)域，之后便迅速應(yīng)用于多種植物的研究[16-21]。目前，對于小麥的研究已比較成熟，Yao Ji等[22]以103份冬小麥為材料對小麥4A和2A染色體上的簡單重復(fù)序列標(biāo)記與農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，檢測到與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)的簡單重復(fù)序列標(biāo)記；Freddy等[23]利用單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism markers，SNP）標(biāo)記對來自于智利、烏拉圭和國際玉米和小麥改良中心的382 個小麥品種進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到與小麥千粒質(zhì)量、株高、產(chǎn)量相關(guān)的穩(wěn)定基因，并發(fā)現(xiàn)位于染色體1A、3A和5A上的QTL可增加小麥水分利用率，從而減少水資源的浪費；Gao Liangliang等[24]利用SNP標(biāo)記對小麥抗莖銹病基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了21 個SNP位點，其中10 個與抗莖銹病基因Sr42有密切關(guān)聯(lián)，抗病基因的獲得為篩選抗病植株做出較大貢獻(xiàn)。全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)在小麥作物上的成功應(yīng)用為鑒定饅頭品質(zhì)相關(guān)位點提供了新的思路和技術(shù)支持。本研究以205 份不同小麥品種為實驗材料，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，旨在得到與饅頭品質(zhì)性狀緊密關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，為下一步結(jié)合分子育種技術(shù)改良饅頭用面粉品質(zhì)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為205 種來自不同國家與地區(qū)的小麥品種，其中203 份來自中國10 個種植冬小麥的省份，剩余2 份分別來自于法國與墨西哥（表1）。供試材料中骨干親本為132 份，高代品系73 份，高代品系均來源于山東省。

表1 供試小麥材料Table1 Information about wheat varieties used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀 美國Stable Micro System公司；BL-220H型分析天平 島津國際貿(mào)易（上海）有限；SF17和面機(jī) 意大利Alaska公司；CR-300型色彩色差計日本美能達(dá)公司；VF-30醒發(fā)箱 廣州富康食品機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗材料表型鑒定

在2014—2015年和2015—2016年間，分別將205 份不同小麥品種種植于山東省德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院與山東省泰安市山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田。種植條件為：每份材料播種3 行，行長2 m，行間距0.25 m，每行播種70 粒，重復(fù)2 次。小麥生長期間，進(jìn)行常規(guī)田間管理，沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的病蟲害現(xiàn)象。

小麥成熟后，進(jìn)行收割，并研磨成面粉，將面粉按照最初來源進(jìn)行編號后參照周素梅等[25]的實驗室饅頭制作方法并略作改進(jìn)。待饅頭冷卻后測量饅頭的質(zhì)量，饅頭的體積采用菜籽置換法測量，體積與質(zhì)量之比即為比容[26]。取每個饅頭外表皮的表面頂端為外表面色澤測量點，選取的外表面測量點要求平整光滑，以確保所測結(jié)果的準(zhǔn)確性，用色差儀測量其L*、a*、b*值，重復(fù)3 次。測量結(jié)束后，用切割機(jī)將饅頭平行切割成3 片，取中間片的內(nèi)瓤中間位置作為內(nèi)表面測量點，測量其L*、a*、b*值，重復(fù)3 次。測量結(jié)束后，取饅頭中間片置于質(zhì)構(gòu)儀上，在TPA模式下采用P35探頭進(jìn)行壓縮實驗[27]，測試前速率3.00 mm/s，測試和測試后速率1.0 mm/s，壓縮距離50%。第1次壓縮結(jié)束后，探頭回到起始位置，等待3 s后進(jìn)行第2次壓縮。

1.3.2 DNA提取和90K SNP芯片分型

根據(jù)稍作改動的Triticarte方法從不同品種小麥幼葉組織中提取DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對DNA濃度和質(zhì)量進(jìn)行測定。委托加利弗尼亞大學(xué)生物技術(shù)檢測中心，使用最新開發(fā)的包含81 587 個SNP位點的小麥90K基因芯片對DNA數(shù)據(jù)進(jìn)行分型，并用GenomeStudio軟件讀取分型結(jié)果并保存。為確保分型數(shù)據(jù)結(jié)果的質(zhì)量，用PLINK v1.07[28]進(jìn)行檢測，選取低基因頻率大于5%和檢出率大于80%的SNP標(biāo)記用于饅頭品質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析[29]，最終得到24 355 個SNP位點。

利用Wang Shichen等[30]整合的遺傳位點信息，對本研究獲得的基因位點進(jìn)行整合，得到實驗群體SNP復(fù)合遺傳圖譜信息（表2）。

表2 SNP復(fù)合遺傳圖譜信息Table2 Information about SNP in the integrated linkage map

1.3.3 性狀與標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)分析

運用TASSEL 3.0軟件中的MLM_Q+K模型對饅頭比容、色澤和質(zhì)構(gòu)性狀與標(biāo)記之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，當(dāng)結(jié)果中關(guān)聯(lián)標(biāo)記P值小于0.001時，認(rèn)為該標(biāo)記與目標(biāo)性狀存在顯著關(guān)聯(lián)；P值小于0.000 1時，認(rèn)為標(biāo)記與目標(biāo)性狀存在極顯著關(guān)聯(lián)，當(dāng)標(biāo)記在2 個及以上環(huán)境中同時被檢測到則認(rèn)為其是目標(biāo)性狀相對穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)位點。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 18.0軟件與TASSEL 3.0軟件統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 比容、色澤與質(zhì)構(gòu)性狀表型變異分析

4 個環(huán)境下饅頭比容、色澤與質(zhì)構(gòu)的表型數(shù)據(jù)如表3～5所示。各性狀均有較大的變異系數(shù)，表3中，E4環(huán)境下饅頭比容性狀的變異系數(shù)最大（19.54%），E1環(huán)境下變異系數(shù)最?。?.45%）；表4中，色澤相關(guān)性狀在E1環(huán)境下內(nèi)表面a*值變異系數(shù)最大（71.73%），E4環(huán)境下外表面L*值變異系數(shù)最?。?.70%）；表5中，E1環(huán)境黏著性變異系數(shù)最大（58.50%），彈性變異系數(shù)最?。?.21%）。除個別環(huán)境外，各性狀的偏度和峰度的絕對值大部分都小于1，符合正態(tài)分布，表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳，適合進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

表3 4 個環(huán)境下饅頭比容在群體中的表型數(shù)據(jù)Table3 Phenotypic data of specific volume traits of steamed bread in four different environments

表4 4 個環(huán)境下饅頭色澤相關(guān)性狀在群體中的表型數(shù)據(jù)Table4 Phenotypic data of color traits of steamed bread in four different environments

表5 4 個環(huán)境下饅頭質(zhì)構(gòu)在群體中的表型數(shù)據(jù)Table5 Phenotypic data of texture traits of steamed bread in four different environments

2.2 SNP標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析

表6 4 個環(huán)境中與饅頭比容性狀相關(guān)的極顯著、高貢獻(xiàn)率和穩(wěn)定位點Table6 Highly significant marker-trait associations (MTAs), MTAs with high genetic contribution and stable MTAs for specific volume traits of steamed bread in four environments

通過對性狀與標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，在顯著水平（P＜0.001）上，共得到42 個比容性狀顯著關(guān)聯(lián)位點，分布于小麥21 條染色體中的16 條，單個位點遺傳變異貢獻(xiàn)率（R2）為6.57%～18.31%。其中8 個極顯著關(guān)聯(lián)位點（P＜0.000 1），同時也是高遺傳變異貢獻(xiàn)率位點，2 個相對穩(wěn)定位點（至少在兩個環(huán)境中同時被檢測到），分布于小麥的2A、2B、2D、3A、4B、6B、7A染色體上。位于7A染色體上的極顯著關(guān)聯(lián)位點wsnp_Ex_c14654_22713386遺傳變異貢獻(xiàn)率最大，可解釋18.31%的表型變異，但只在E4環(huán)境中檢測到（表6）。

表7 4 個環(huán)境中與饅頭色澤相關(guān)性狀極顯著（P＜0.000 1）、高貢獻(xiàn)率和穩(wěn)定位點Table7 Highly significant MTAs, MTAs with high genetic contribution and stable MTAs for color traits of steamed bread in four environments

4 個環(huán)境中共檢測到276 個饅頭色澤性狀關(guān)聯(lián)位點，其中23 個極顯著關(guān)聯(lián)位點，9 個相對穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點，30 個高遺傳變異貢獻(xiàn)率位點，分布于小麥21 條染色體中的13 條（1A、1B、1D、2A、2B、3A、3B、4A、5B、6A、6D、7A和7D），單個位點遺傳變異貢獻(xiàn)率為7.00%～14.07%。位于7A染色體上的極顯著位點Kukri_c18677_823表現(xiàn)出最大的遺傳變異貢獻(xiàn)率，可解釋14.07%的表型變異，但只在E4環(huán)境中檢測到（表7）。

表8 4 個環(huán)境中與饅頭質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀極顯著、高貢獻(xiàn)率和穩(wěn)定位點Table8 Highly significant MTAs, MTAs with high genetic contribution and stable MTAs for texture traits of steamed bread in four environments

通過對饅頭質(zhì)構(gòu)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共檢測到313 個質(zhì)構(gòu)性狀顯著關(guān)聯(lián)位點，分布于小麥的17 條染色體上，單個位點遺傳變異貢獻(xiàn)率為5.49%～25.14%。其中31 個極顯著關(guān)聯(lián)位點，11 個相對穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點，46 個高遺傳變異貢獻(xiàn)率位點，分布于小麥的15條染色體上（1A、1B、2A、2B、2D、3A、3B、4A、5A、5B、5D、6A、7A、7B 和7D）。同時，檢測到5 個極顯著位點，如2D染色體上黏聚性關(guān)聯(lián)位點Kukri_c13329_800、7B染色體上咀嚼性關(guān)聯(lián)位點Tdurum_contig61884_836等，在兩個環(huán)境中表達(dá)，且貢獻(xiàn)率大于10%，為主效關(guān)聯(lián)位點（表8）。

3 結(jié) 論

利用24 355 個分布于小麥全基因組的SNP位點對205 種小麥粉饅頭的主要品質(zhì)性狀（比容、色澤、質(zhì)構(gòu)）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。檢測到42 個饅頭比容性狀顯著關(guān)聯(lián)位點，其中8 個極顯著（P＜0.000 1）且高遺傳貢獻(xiàn)位點，2 個相對穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點，分布于小麥的7 條染色體上；276 個饅頭色澤性狀顯著關(guān)聯(lián)位點，其中23 個極顯著關(guān)聯(lián)位點，9 個相對穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點，30 個高遺傳變異貢獻(xiàn)率位點，分布于小麥的13 條染色體上。313 個饅頭質(zhì)構(gòu)性狀顯著關(guān)聯(lián)位點，其中31 個極顯著關(guān)聯(lián)位點，11 個相對穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點，46 個高遺傳變異貢獻(xiàn)率位點，分布于小麥的15 條染色體上。同時，檢測到5 個質(zhì)構(gòu)性狀主效關(guān)聯(lián)位點。這些位點的獲得可用于結(jié)合小麥分子輔助育種技術(shù)，為改良饅頭用小麥粉鑒定基礎(chǔ)。