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        基于多重修飾酶電極技術(shù)檢測(cè)大豆油中磷脂含量

        2019-01-28 08:06:52王立琦劉雨琪陳穎淑王睿智劉亞楠隋玉林于殿宇
        食品科學(xué) 2019年2期
        關(guān)鍵詞:效果檢測(cè)模型

        王立琦,劉雨琪,陳穎淑,王 雯,王睿智,劉亞楠,張 欣,隋玉林,,于殿宇,

        (1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150028;2.黑龍江省電子商務(wù)與信息處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150028;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150076;4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

        脫膠是大豆油精煉過(guò)程中的重要環(huán)節(jié),目的是將大豆毛油中的磷脂等膠質(zhì)脫掉,是后續(xù)脫色和脫臭的基礎(chǔ),因此在油脂加工過(guò)程中需要不斷檢測(cè)大豆油中磷脂含量。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是進(jìn)行化學(xué)分析,檢測(cè)速度慢、成本高、受人為因素和實(shí)驗(yàn)環(huán)境影響大、易污染環(huán)境,更不利于在線檢測(cè)和調(diào)控[1-3]。大豆毛油中磷脂的含量高,其中卵磷脂占主要組成部分。

        磷脂的傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括紅外吸收光譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法[4]、薄層色譜法、核磁共振氫譜法[5]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]等。但這些檢測(cè)方法存在成本高、操作復(fù)雜、分析速度慢、難以快速實(shí)時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)。因此檢測(cè)大豆毛油中的磷脂先從單一的卵磷脂入手,并逐步應(yīng)用到含有多組分的大豆毛油中。

        而電化學(xué)分析技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、易于實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[7-8],近年來(lái)在食品安全領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。絲網(wǎng)印刷電極是一種一次性電極,具有制作簡(jiǎn)單、成本低廉、靈敏度高、響應(yīng)速度快、便于攜帶等特點(diǎn)[9]。方便對(duì)市場(chǎng)上各種分析物進(jìn)行可重復(fù)的和一次性的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[10]。絲網(wǎng)印刷電極生物傳感器能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)氣相色譜-質(zhì)譜方法檢測(cè)費(fèi)用高、速度慢等不足,常用于農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)[11-13],在食品的快速檢測(cè)中也具有諸多優(yōu)點(diǎn),因而廣泛用于食品衛(wèi)生安全性的檢測(cè)[14]。Li Shuguo等[15]制備了聚吡咯修飾電極的電化學(xué)傳感器,利用線性電位伏安法檢測(cè)植物油中酸價(jià)的含量,與傳統(tǒng)滴定法相比,該檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度高,需要少量的植物油樣品,無(wú)需預(yù)處理。Hsu等[16]制備了固定酶修飾印刷絲網(wǎng)電極的電化學(xué)傳感器,實(shí)現(xiàn)對(duì)甘油二脂的測(cè)定,檢測(cè)靈敏度高;Robledo等[17]采用電化學(xué)方法結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)測(cè)定食用植物油中生育酚同系物的含量,結(jié)果顯示,食用油中生育酚含量實(shí)測(cè)值和生產(chǎn)商標(biāo)注VE含量基本一致;王麗然等[18]采用殼聚糖為固定化材料,制備了有機(jī)相辣根過(guò)氧化物酶?jìng)鞲衅?,?jīng)循環(huán)伏安法實(shí)現(xiàn)了對(duì)植物油中過(guò)氧化值含量的測(cè)定,檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于國(guó)標(biāo)碘量法,并且檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確度較高;郭敬軒等[19]利用多孔碳修飾玻碳電極并通過(guò)循環(huán)伏安法檢測(cè)油脂中抗氧化劑丁基羥基茴香醚的含量;劉曉偉等[20]基于電化學(xué)方法,建立了電流型酶?jìng)鞲衅?,?shí)現(xiàn)了對(duì)花生油中黃曲霉素B1的快速檢測(cè)。

        目前,國(guó)內(nèi)外鮮有關(guān)于磷脂電化學(xué)方法檢測(cè)的報(bào)道,本研究參考磷脂的性質(zhì)和油脂中其他物質(zhì)的檢測(cè)方法,采用絲網(wǎng)印刷電極,以四氧化三鐵-殼聚糖納米復(fù)合物,然后用交聯(lián)劑將辣根過(guò)氧化物酶和膽堿氧化酶依次交聯(lián)到修飾絲網(wǎng)印刷電極表面,制備多重修飾酶電極。構(gòu)建一種酶電極,通過(guò)電化學(xué)方法間接或直接檢測(cè)分析磷脂的含量,具有廣泛的應(yīng)用前景。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        一級(jí)大豆油 九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司;磷脂酶D(168 U/mg)、膽堿氧化酶(18 U/mg)、辣根過(guò)氧化物酶(265 U/mg)、磷脂酰膽堿(99%) 美國(guó)Sigma公司;納米四氧化三鐵 汕頭市西隴化工廠有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        CHI660D電化學(xué)工作站 上海辰華儀器公司;EI3002絲網(wǎng)印刷電極 南京中科電極有限公司;MATLAB R2015a(Math Works)、Unscrambler X10.3挪威CAMO公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品處理

        以一級(jí)大豆油為基料,通過(guò)添加一定量的大豆粉末磷脂、磷脂酶D(10 U/mL)及1%的Triton-X100作為乳化劑,制備出40 個(gè)磷脂含量不同的混合大豆油樣品,并采用國(guó)標(biāo)法(鉬藍(lán)比色法)測(cè)量樣品中磷脂含量標(biāo)準(zhǔn)值。

        1.3.2 多重修飾酶電極的制備

        由于磷脂酶D酶解磷脂生成磷脂酸和膽堿過(guò)程中不產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移,針對(duì)此問(wèn)題本實(shí)驗(yàn)研制多重修飾酶電極傳感器,制備四氧化三鐵-殼聚糖納米復(fù)合物,利用乙酸添加四氧化三鐵納米粉,超聲處理分散60 min,最后獲得一種均一穩(wěn)定的黑色懸浮液。所獲得的高度分散黑色懸浮液為四氧化三鐵-殼聚糖納米復(fù)合物,將其均勻涂于經(jīng)預(yù)處理的絲網(wǎng)印刷電極表面,獲得四氧化三鐵-殼聚糖修飾電極,然后將2.5 μL酶活力為0.8 U/μL的辣根過(guò)氧化物酶溶液和2.5 μL 1.2 U/μL的膽堿氧化酶溶液分別通過(guò)戊二醛交聯(lián)固定在修飾電極上,制得多重修飾酶電極傳感器,組裝過(guò)程見(jiàn)圖1。

        圖1 多重修飾酶電極的組裝過(guò)程Fig.1 Assembling of multiple modified enzyme electrodes

        1.3.3 電化學(xué)數(shù)據(jù)采集

        多重修飾酶電極使磷脂酶解副產(chǎn)物膽堿繼續(xù)氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫,再對(duì)酶解副產(chǎn)物過(guò)氧化氫進(jìn)一步酶解,使本不產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移的酶解過(guò)程,通過(guò)對(duì)其酶解副產(chǎn)物逐步酶解,間接產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移并轉(zhuǎn)化成電信號(hào),然后將多重修飾酶電極與電化學(xué)工作站連接,采用循環(huán)伏安法掃描,電位掃描范圍為-0.6~0.8 V,掃描速率為0.01 V/s[21]。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        首先,對(duì)采集的原始電化學(xué)數(shù)據(jù)分別利用Savitzky-Golay平滑濾波和dbN系列小波進(jìn)行去噪處理,然后再分別利用還原峰電流與磷脂含量直線擬合、主成分回歸、偏最小二乘回歸和支持向量機(jī)回歸4 種方法建立校正回歸模型。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 磷脂循環(huán)伏安曲線

        圖2 磷脂的循環(huán)伏安曲線Fig.2 Cyclic voltammograms of phospholipids at different concentrations

        如圖2所示,磷脂質(zhì)量濃度為5.87~304.89 mg/L,隨著磷脂質(zhì)量濃度的增加,大豆油樣品的循環(huán)伏安曲線的還原峰電流越小,在磷脂質(zhì)量濃度為5.87~304.89 mg/L范圍內(nèi),還原峰電流大小與磷脂的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

        2.2 電化學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理

        由于人工操作失誤、儀器異常、環(huán)境(如溫度、濕度等因素的變化)或者樣品本身等原因[22],測(cè)定樣品時(shí)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)個(gè)別異常樣本,這些異常樣本不能用于模型的建立,需將其剔除。本實(shí)驗(yàn)基于原始電化學(xué)數(shù)據(jù)建立了偏最小二乘校正模型,根據(jù)預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的偏差剔除異常樣本2 個(gè),為提高模型預(yù)測(cè)精度,再分別利用Savitzky-Golay平滑濾波和dbN系列小波對(duì)原始電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行去噪處理。

        2.2.1 平滑去噪

        Savitzky-Golay法最突出的優(yōu)點(diǎn)是它能夠有效地保留數(shù)據(jù)的原始特征,其本質(zhì)就是利用窗口內(nèi)部各個(gè)點(diǎn)之間的加權(quán)來(lái)計(jì)算平滑后的新值,關(guān)鍵在于如何選擇多項(xiàng)式次數(shù)和窗口點(diǎn)數(shù),選擇不同的組合,結(jié)果也會(huì)不同[23]。本實(shí)驗(yàn)選取窗函數(shù)大小為5~15 點(diǎn)之間的奇數(shù),多項(xiàng)式次數(shù)為2、3、4、5進(jìn)行驗(yàn)證,并通過(guò)平滑降噪后的均方誤差、信噪比、數(shù)據(jù)能量占原始能量的比例和平滑度來(lái)評(píng)價(jià)去噪的效果。窗函數(shù)較大可以提高信噪比,但難免會(huì)導(dǎo)致信號(hào)失真,經(jīng)分析對(duì)比平滑去噪效果可知,窗函數(shù)大小為13 點(diǎn)、多項(xiàng)式次數(shù)為2時(shí),平滑處理去噪效果最好,其均方誤差為0.041 685,信噪比為28.26,數(shù)據(jù)能量占原始能量的比例為0.989 4,平滑度為0.409 61。為獲得電化學(xué)數(shù)據(jù)降噪處理的最佳效果,本實(shí)驗(yàn)再采用小波去噪法對(duì)電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪處理。

        2.2.2 小波去噪

        采用Daubechies小波對(duì)電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行多尺度小波分解以達(dá)到消除噪聲的目的。Daubechies小波一般簡(jiǎn)寫(xiě)成dbN,N是小波的階數(shù),Daubechies小波基是一個(gè)小波族[24],db1~db10有10 個(gè)小波基,如何選擇最適合的小波基,目前的研究報(bào)道中鮮見(jiàn)有較好的方法,只能通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選。本實(shí)驗(yàn)中樣本長(zhǎng)度為282,db9、db10最大分解尺度3,為方便分析比較,將其他小波基的分解尺度也設(shè)定為3,閾值方式選擇基于Stein無(wú)偏似然估計(jì)的軟閾值估計(jì),以不同小波基對(duì)電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行去噪,并獲得了不同小波基函數(shù)去噪后的均方誤差、信噪比、去噪信號(hào)在原信號(hào)中的能量比例和平滑度,經(jīng)分析比較可知,db6小波基函數(shù)時(shí),平滑度最小為0.086 19,去噪效果最好,并且其均方誤差較小為0.011 37,信噪比較大為30.21,去噪信號(hào)在原信號(hào)中的能量比例為0.999 8。

        信號(hào)的小波分解需根據(jù)信號(hào)長(zhǎng)度確定最大分解層數(shù),本實(shí)驗(yàn)中校正集樣本長(zhǎng)度為282,最大分解尺度為4,表明本實(shí)驗(yàn)的電化學(xué)數(shù)據(jù)在去噪中的分解尺度可為2、3或4。對(duì)于多少尺度分解能達(dá)到最佳效果,還要通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法確定,將db6小波基在不同分解尺度和4 種閾值方式下分別對(duì)電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪處理,經(jīng)綜合比較分析去噪結(jié)果發(fā)現(xiàn)db6經(jīng)3尺度分解去噪效果較好,且4 種閾值方式中基于Stein無(wú)偏似然估計(jì)的軟閾值估計(jì)方式去噪的均方誤差為0.010 77,信噪比為30.21,去噪信號(hào)在原信號(hào)中的能量比例為0.999 8,平滑度為0.086 19,去噪效果最佳。

        綜合以上研究結(jié)果,將基于Stein無(wú)偏似然估計(jì)的軟閾值估計(jì)方式的db6小波基對(duì)大豆油脂的電化學(xué)伏安曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行三層小波分解去噪處理與Savitzky-Golay平滑處理最佳效果進(jìn)行分析對(duì)比,經(jīng)小波去噪和平滑處理后的伏安曲線降噪效果對(duì)比見(jiàn)表1。經(jīng)表1對(duì)比分析,整體來(lái)看小波去噪效果明顯優(yōu)于Savitzky-Golay平滑處理,因此本實(shí)驗(yàn)采用小波去噪方法對(duì)原始電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

        表1 經(jīng)小波去噪和平滑處理后的伏安曲線降噪效果對(duì)比Table1 Comparison of noise reduction of voltammograms by Savitzky-Golay smoothing filter and db6 wavelet three-layer decomposition

        2.3 校正模型的建立

        為構(gòu)建可靠、穩(wěn)定的分析校正模型,分別采用4 種方法建立去噪后的電化學(xué)數(shù)據(jù)與磷脂質(zhì)量濃度之間的回歸模型,首先利用還原峰電流與磷脂含量之間進(jìn)行直線擬合,再采用主成分回歸[25]、偏最小二乘回歸[26]和支持向量機(jī)回歸[27]建立校正回歸模型,并采用決定系數(shù)R2、預(yù)測(cè)均方根誤差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3 種評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)衡量模型預(yù)測(cè)效果,通過(guò)分析對(duì)比4 種方法的建模效果,以期尋找出最佳磷脂含量檢測(cè)模型。

        2.3.1 峰電流與磷脂質(zhì)量濃度的線性擬合

        多重修飾酶電極在不同質(zhì)量濃度的磷脂溶液中經(jīng)掃描得到其電流-電位循環(huán)伏安曲線,為明確循環(huán)伏安曲線的峰電流與磷脂質(zhì)量濃度的關(guān)系,首先提取曲線的峰值,借助還原峰電流與磷脂質(zhì)量濃度化學(xué)值之間進(jìn)行簡(jiǎn)單的單變量線性擬合。

        圖3 還原峰電流與磷脂質(zhì)量濃度關(guān)系圖Fig.3 Relationship between reduction peak current and phospholipid concentration

        將提取還原峰電流與磷脂質(zhì)量濃度化學(xué)值進(jìn)行簡(jiǎn)單的線性擬合,如圖3所示。隨著磷脂質(zhì)量濃度的增加,還原峰電流不斷減小,其線性回歸方程為ipc=-1.02lgC+4.341,磷脂質(zhì)量濃度在5.87~304.89 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢出限為1.68 mg/L(RSN=3)。其決定系數(shù)R2為0.987 6,預(yù)測(cè)均方根誤差為0.557 1,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.93%。

        2.3.2 回歸校正模型

        由于循環(huán)伏安曲線的峰電流易受儀器或其他環(huán)境因素的影響而產(chǎn)生波動(dòng),實(shí)際和提取的峰電流可能存在一定的偏差[28],所以簡(jiǎn)單的單變量線性擬合模型對(duì)磷脂質(zhì)量濃度的預(yù)測(cè)并不一定能夠滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)要求。為建立更高精度的預(yù)測(cè)模型,再利用主成分回歸、偏最小二乘回歸及支持向量機(jī)回歸在電化學(xué)數(shù)據(jù)與磷脂質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)值之間建立回歸校正模型,以期尋找最佳的磷脂檢測(cè)模型。

        首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本分集,將38 個(gè)樣品按磷脂含量的多少進(jìn)行排序,按照一定梯度變化從中選取28 組作為訓(xùn)練集樣本,用于建立模型,剩下的10 組數(shù)據(jù)作為預(yù)測(cè)集樣本,用于驗(yàn)證模型的適用性,訓(xùn)練集樣品和預(yù)測(cè)樣品集的磷脂含量平均值應(yīng)盡量接近,并且訓(xùn)練集包含樣品中的最大值和最小值,樣本校正集和預(yù)測(cè)集統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 樣本校正集和預(yù)測(cè)集統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table2 Statistical analysis of calibration and prediction sets

        利用美國(guó)MathWorks公司的Matlab R2015a數(shù)據(jù)分析軟件中的主成分回歸算法[29]、偏最小二乘回歸算法及Unscrambler軟件中的支持向量機(jī)回歸算法[30]并采用4 種核函數(shù)即線性核函數(shù)、多項(xiàng)式核函數(shù)、徑向基核函數(shù)和神經(jīng)元的非線性作用函數(shù)核函數(shù)對(duì)大豆油中磷脂含量的化學(xué)值和電化學(xué)數(shù)據(jù)建立回歸校正模型,然后將預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值進(jìn)行對(duì)比,分析計(jì)算其誤差。經(jīng)研究,基于神經(jīng)元的非線性作用函數(shù)核函數(shù)的支持向量機(jī)回歸建模效果很差,所以之后將不再進(jìn)行討論,建模效果評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)比見(jiàn)表3。

        表3 建模效果評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)比Table3 Comparison of prediction performances of regression models

        由表3可以看出,主成分回歸模型建立效果比直線擬合差,偏最小二乘回歸及支持向量機(jī)回歸模型建立效果均優(yōu)于直線擬合模型。經(jīng)分析比較可知,基于徑向基核函數(shù)支持向量機(jī)回歸方法建立回歸校正模型對(duì)未知樣品的預(yù)測(cè)效果最佳,支持向量機(jī)回歸(徑向基核函數(shù))的回歸預(yù)測(cè)模型如圖4所示。

        圖4 支持向量機(jī)回歸(徑向基核函數(shù))回歸預(yù)測(cè)模型Fig.4 SVMR prediction model (based on radial basis function)

        基于徑向基核函數(shù)的支持向量機(jī)回歸對(duì)電化學(xué)數(shù)據(jù)與磷脂含量標(biāo)準(zhǔn)值建立的回歸校正模型對(duì)未知樣品預(yù)測(cè)效果最佳,樣本均分布在擬合線附近,其模型的決定系數(shù)R2為0.998 7,預(yù)測(cè)均方根誤差為0.288 9,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.55%,可以滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)要求。

        3 結(jié) 論

        利用多重修飾的酶電極采集不同磷脂含量的大豆油樣本的電化學(xué)循環(huán)伏安曲線,通過(guò)去噪處理使循環(huán)伏安曲線的還原峰電流與大豆油中的磷脂含量進(jìn)行直線擬合。再分別利用主成分回歸、偏最小二乘回歸和支持向量機(jī)回歸4 種方法根據(jù)其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)值建立回歸預(yù)測(cè)模型,研究發(fā)現(xiàn)基于徑向基核函數(shù)的支持向量機(jī)回歸模型預(yù)測(cè)效果最佳,統(tǒng)計(jì)指標(biāo)均達(dá)到預(yù)期效果,滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)要求。本研究可為實(shí)現(xiàn)油脂中磷脂實(shí)時(shí)有效的在線檢測(cè)提供理論依據(jù)。

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