王立琦，劉雨琪，陳穎淑，王 雯，王睿智，劉亞楠，張 欣，隋玉林,，于殿宇,

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.黑龍江省電子商務(wù)與信息處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150028；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

脫膠是大豆油精煉過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，目的是將大豆毛油中的磷脂等膠質(zhì)脫掉，是后續(xù)脫色和脫臭的基礎(chǔ)，因此在油脂加工過(guò)程中需要不斷檢測(cè)大豆油中磷脂含量。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是進(jìn)行化學(xué)分析，檢測(cè)速度慢、成本高、受人為因素和實(shí)驗(yàn)環(huán)境影響大、易污染環(huán)境，更不利于在線檢測(cè)和調(diào)控[1-3]。大豆毛油中磷脂的含量高，其中卵磷脂占主要組成部分。

磷脂的傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括紅外吸收光譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法[4]、薄層色譜法、核磁共振氫譜法[5]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]等。但這些檢測(cè)方法存在成本高、操作復(fù)雜、分析速度慢、難以快速實(shí)時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)。因此檢測(cè)大豆毛油中的磷脂先從單一的卵磷脂入手，并逐步應(yīng)用到含有多組分的大豆毛油中。

而電化學(xué)分析技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、易于實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[7-8]，近年來(lái)在食品安全領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。絲網(wǎng)印刷電極是一種一次性電極，具有制作簡(jiǎn)單、成本低廉、靈敏度高、響應(yīng)速度快、便于攜帶等特點(diǎn)[9]。方便對(duì)市場(chǎng)上各種分析物進(jìn)行可重復(fù)的和一次性的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[10]。絲網(wǎng)印刷電極生物傳感器能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)氣相色譜-質(zhì)譜方法檢測(cè)費(fèi)用高、速度慢等不足，常用于農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)[11-13]，在食品的快速檢測(cè)中也具有諸多優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛用于食品衛(wèi)生安全性的檢測(cè)[14]。Li Shuguo等[15]制備了聚吡咯修飾電極的電化學(xué)傳感器，利用線性電位伏安法檢測(cè)植物油中酸價(jià)的含量，與傳統(tǒng)滴定法相比，該檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度高，需要少量的植物油樣品，無(wú)需預(yù)處理。Hsu等[16]制備了固定酶修飾印刷絲網(wǎng)電極的電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)甘油二脂的測(cè)定，檢測(cè)靈敏度高；Robledo等[17]采用電化學(xué)方法結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)測(cè)定食用植物油中生育酚同系物的含量，結(jié)果顯示，食用油中生育酚含量實(shí)測(cè)值和生產(chǎn)商標(biāo)注VE含量基本一致；王麗然等[18]采用殼聚糖為固定化材料，制備了有機(jī)相辣根過(guò)氧化物酶?jìng)鞲衅?，?jīng)循環(huán)伏安法實(shí)現(xiàn)了對(duì)植物油中過(guò)氧化值含量的測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于國(guó)標(biāo)碘量法，并且檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確度較高；郭敬軒等[19]利用多孔碳修飾玻碳電極并通過(guò)循環(huán)伏安法檢測(cè)油脂中抗氧化劑丁基羥基茴香醚的含量；劉曉偉等[20]基于電化學(xué)方法，建立了電流型酶?jìng)鞲衅?，?shí)現(xiàn)了對(duì)花生油中黃曲霉素B1的快速檢測(cè)。

目前，國(guó)內(nèi)外鮮有關(guān)于磷脂電化學(xué)方法檢測(cè)的報(bào)道，本研究參考磷脂的性質(zhì)和油脂中其他物質(zhì)的檢測(cè)方法，采用絲網(wǎng)印刷電極，以四氧化三鐵-殼聚糖納米復(fù)合物，然后用交聯(lián)劑將辣根過(guò)氧化物酶和膽堿氧化酶依次交聯(lián)到修飾絲網(wǎng)印刷電極表面，制備多重修飾酶電極。構(gòu)建一種酶電極，通過(guò)電化學(xué)方法間接或直接檢測(cè)分析磷脂的含量，具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一級(jí)大豆油 九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司；磷脂酶D（168 U/mg）、膽堿氧化酶（18 U/mg）、辣根過(guò)氧化物酶（265 U/mg）、磷脂酰膽堿（99%） 美國(guó)Sigma公司；納米四氧化三鐵 汕頭市西隴化工廠有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI660D電化學(xué)工作站 上海辰華儀器公司；EI3002絲網(wǎng)印刷電極 南京中科電極有限公司；MATLAB R2015a（Math Works）、Unscrambler X10.3挪威CAMO公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

以一級(jí)大豆油為基料，通過(guò)添加一定量的大豆粉末磷脂、磷脂酶D（10 U/mL）及1%的Triton-X100作為乳化劑，制備出40 個(gè)磷脂含量不同的混合大豆油樣品，并采用國(guó)標(biāo)法（鉬藍(lán)比色法）測(cè)量樣品中磷脂含量標(biāo)準(zhǔn)值。

1.3.2 多重修飾酶電極的制備

由于磷脂酶D酶解磷脂生成磷脂酸和膽堿過(guò)程中不產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移，針對(duì)此問(wèn)題本實(shí)驗(yàn)研制多重修飾酶電極傳感器，制備四氧化三鐵-殼聚糖納米復(fù)合物，利用乙酸添加四氧化三鐵納米粉，超聲處理分散60 min，最后獲得一種均一穩(wěn)定的黑色懸浮液。所獲得的高度分散黑色懸浮液為四氧化三鐵-殼聚糖納米復(fù)合物，將其均勻涂于經(jīng)預(yù)處理的絲網(wǎng)印刷電極表面，獲得四氧化三鐵-殼聚糖修飾電極，然后將2.5 μL酶活力為0.8 U/μL的辣根過(guò)氧化物酶溶液和2.5 μL 1.2 U/μL的膽堿氧化酶溶液分別通過(guò)戊二醛交聯(lián)固定在修飾電極上，制得多重修飾酶電極傳感器，組裝過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 多重修飾酶電極的組裝過(guò)程Fig.1 Assembling of multiple modified enzyme electrodes

1.3.3 電化學(xué)數(shù)據(jù)采集

多重修飾酶電極使磷脂酶解副產(chǎn)物膽堿繼續(xù)氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫，再對(duì)酶解副產(chǎn)物過(guò)氧化氫進(jìn)一步酶解，使本不產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移的酶解過(guò)程，通過(guò)對(duì)其酶解副產(chǎn)物逐步酶解，間接產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移并轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，然后將多重修飾酶電極與電化學(xué)工作站連接，采用循環(huán)伏安法掃描，電位掃描范圍為－0.6～0.8 V，掃描速率為0.01 V/s[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

首先，對(duì)采集的原始電化學(xué)數(shù)據(jù)分別利用Savitzky-Golay平滑濾波和dbN系列小波進(jìn)行去噪處理，然后再分別利用還原峰電流與磷脂含量直線擬合、主成分回歸、偏最小二乘回歸和支持向量機(jī)回歸4 種方法建立校正回歸模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脂循環(huán)伏安曲線

圖2 磷脂的循環(huán)伏安曲線Fig.2 Cyclic voltammograms of phospholipids at different concentrations

如圖2所示，磷脂質(zhì)量濃度為5.87～304.89 mg/L，隨著磷脂質(zhì)量濃度的增加，大豆油樣品的循環(huán)伏安曲線的還原峰電流越小，在磷脂質(zhì)量濃度為5.87～304.89 mg/L范圍內(nèi)，還原峰電流大小與磷脂的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 電化學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理

由于人工操作失誤、儀器異常、環(huán)境（如溫度、濕度等因素的變化）或者樣品本身等原因[22]，測(cè)定樣品時(shí)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)個(gè)別異常樣本，這些異常樣本不能用于模型的建立，需將其剔除。本實(shí)驗(yàn)基于原始電化學(xué)數(shù)據(jù)建立了偏最小二乘校正模型，根據(jù)預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的偏差剔除異常樣本2 個(gè)，為提高模型預(yù)測(cè)精度，再分別利用Savitzky-Golay平滑濾波和dbN系列小波對(duì)原始電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行去噪處理。

2.2.1 平滑去噪

Savitzky-Golay法最突出的優(yōu)點(diǎn)是它能夠有效地保留數(shù)據(jù)的原始特征，其本質(zhì)就是利用窗口內(nèi)部各個(gè)點(diǎn)之間的加權(quán)來(lái)計(jì)算平滑后的新值，關(guān)鍵在于如何選擇多項(xiàng)式次數(shù)和窗口點(diǎn)數(shù)，選擇不同的組合，結(jié)果也會(huì)不同[23]。本實(shí)驗(yàn)選取窗函數(shù)大小為5～15 點(diǎn)之間的奇數(shù)，多項(xiàng)式次數(shù)為2、3、4、5進(jìn)行驗(yàn)證，并通過(guò)平滑降噪后的均方誤差、信噪比、數(shù)據(jù)能量占原始能量的比例和平滑度來(lái)評(píng)價(jià)去噪的效果。窗函數(shù)較大可以提高信噪比，但難免會(huì)導(dǎo)致信號(hào)失真，經(jīng)分析對(duì)比平滑去噪效果可知，窗函數(shù)大小為13 點(diǎn)、多項(xiàng)式次數(shù)為2時(shí)，平滑處理去噪效果最好，其均方誤差為0.041 685，信噪比為28.26，數(shù)據(jù)能量占原始能量的比例為0.989 4，平滑度為0.409 61。為獲得電化學(xué)數(shù)據(jù)降噪處理的最佳效果，本實(shí)驗(yàn)再采用小波去噪法對(duì)電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪處理。

2.2.2 小波去噪

采用Daubechies小波對(duì)電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行多尺度小波分解以達(dá)到消除噪聲的目的。Daubechies小波一般簡(jiǎn)寫(xiě)成dbN，N是小波的階數(shù)，Daubechies小波基是一個(gè)小波族[24]，db1～db10有10 個(gè)小波基，如何選擇最適合的小波基，目前的研究報(bào)道中鮮見(jiàn)有較好的方法，只能通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選。本實(shí)驗(yàn)中樣本長(zhǎng)度為282，db9、db10最大分解尺度3，為方便分析比較，將其他小波基的分解尺度也設(shè)定為3，閾值方式選擇基于Stein無(wú)偏似然估計(jì)的軟閾值估計(jì)，以不同小波基對(duì)電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行去噪，并獲得了不同小波基函數(shù)去噪后的均方誤差、信噪比、去噪信號(hào)在原信號(hào)中的能量比例和平滑度，經(jīng)分析比較可知，db6小波基函數(shù)時(shí)，平滑度最小為0.086 19，去噪效果最好，并且其均方誤差較小為0.011 37，信噪比較大為30.21，去噪信號(hào)在原信號(hào)中的能量比例為0.999 8。

信號(hào)的小波分解需根據(jù)信號(hào)長(zhǎng)度確定最大分解層數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中校正集樣本長(zhǎng)度為282，最大分解尺度為4，表明本實(shí)驗(yàn)的電化學(xué)數(shù)據(jù)在去噪中的分解尺度可為2、3或4。對(duì)于多少尺度分解能達(dá)到最佳效果，還要通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法確定，將db6小波基在不同分解尺度和4 種閾值方式下分別對(duì)電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪處理，經(jīng)綜合比較分析去噪結(jié)果發(fā)現(xiàn)db6經(jīng)3尺度分解去噪效果較好，且4 種閾值方式中基于Stein無(wú)偏似然估計(jì)的軟閾值估計(jì)方式去噪的均方誤差為0.010 77，信噪比為30.21，去噪信號(hào)在原信號(hào)中的能量比例為0.999 8，平滑度為0.086 19，去噪效果最佳。

綜合以上研究結(jié)果，將基于Stein無(wú)偏似然估計(jì)的軟閾值估計(jì)方式的db6小波基對(duì)大豆油脂的電化學(xué)伏安曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行三層小波分解去噪處理與Savitzky-Golay平滑處理最佳效果進(jìn)行分析對(duì)比，經(jīng)小波去噪和平滑處理后的伏安曲線降噪效果對(duì)比見(jiàn)表1。經(jīng)表1對(duì)比分析，整體來(lái)看小波去噪效果明顯優(yōu)于Savitzky-Golay平滑處理，因此本實(shí)驗(yàn)采用小波去噪方法對(duì)原始電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

表1 經(jīng)小波去噪和平滑處理后的伏安曲線降噪效果對(duì)比Table1 Comparison of noise reduction of voltammograms by Savitzky-Golay smoothing filter and db6 wavelet three-layer decomposition

2.3 校正模型的建立

為構(gòu)建可靠、穩(wěn)定的分析校正模型，分別采用4 種方法建立去噪后的電化學(xué)數(shù)據(jù)與磷脂質(zhì)量濃度之間的回歸模型，首先利用還原峰電流與磷脂含量之間進(jìn)行直線擬合，再采用主成分回歸[25]、偏最小二乘回歸[26]和支持向量機(jī)回歸[27]建立校正回歸模型，并采用決定系數(shù)R2、預(yù)測(cè)均方根誤差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3 種評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)衡量模型預(yù)測(cè)效果，通過(guò)分析對(duì)比4 種方法的建模效果，以期尋找出最佳磷脂含量檢測(cè)模型。

2.3.1 峰電流與磷脂質(zhì)量濃度的線性擬合

多重修飾酶電極在不同質(zhì)量濃度的磷脂溶液中經(jīng)掃描得到其電流-電位循環(huán)伏安曲線，為明確循環(huán)伏安曲線的峰電流與磷脂質(zhì)量濃度的關(guān)系，首先提取曲線的峰值，借助還原峰電流與磷脂質(zhì)量濃度化學(xué)值之間進(jìn)行簡(jiǎn)單的單變量線性擬合。

圖3 還原峰電流與磷脂質(zhì)量濃度關(guān)系圖Fig.3 Relationship between reduction peak current and phospholipid concentration

將提取還原峰電流與磷脂質(zhì)量濃度化學(xué)值進(jìn)行簡(jiǎn)單的線性擬合，如圖3所示。隨著磷脂質(zhì)量濃度的增加，還原峰電流不斷減小，其線性回歸方程為ipc＝－1.02lgC+4.341，磷脂質(zhì)量濃度在5.87～304.89 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為1.68 mg/L（RSN=3）。其決定系數(shù)R2為0.987 6，預(yù)測(cè)均方根誤差為0.557 1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.93%。

2.3.2 回歸校正模型

由于循環(huán)伏安曲線的峰電流易受儀器或其他環(huán)境因素的影響而產(chǎn)生波動(dòng)，實(shí)際和提取的峰電流可能存在一定的偏差[28]，所以簡(jiǎn)單的單變量線性擬合模型對(duì)磷脂質(zhì)量濃度的預(yù)測(cè)并不一定能夠滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)要求。為建立更高精度的預(yù)測(cè)模型，再利用主成分回歸、偏最小二乘回歸及支持向量機(jī)回歸在電化學(xué)數(shù)據(jù)與磷脂質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)值之間建立回歸校正模型，以期尋找最佳的磷脂檢測(cè)模型。

首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本分集，將38 個(gè)樣品按磷脂含量的多少進(jìn)行排序，按照一定梯度變化從中選取28 組作為訓(xùn)練集樣本，用于建立模型，剩下的10 組數(shù)據(jù)作為預(yù)測(cè)集樣本，用于驗(yàn)證模型的適用性，訓(xùn)練集樣品和預(yù)測(cè)樣品集的磷脂含量平均值應(yīng)盡量接近，并且訓(xùn)練集包含樣品中的最大值和最小值，樣本校正集和預(yù)測(cè)集統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣本校正集和預(yù)測(cè)集統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table2 Statistical analysis of calibration and prediction sets

利用美國(guó)MathWorks公司的Matlab R2015a數(shù)據(jù)分析軟件中的主成分回歸算法[29]、偏最小二乘回歸算法及Unscrambler軟件中的支持向量機(jī)回歸算法[30]并采用4 種核函數(shù)即線性核函數(shù)、多項(xiàng)式核函數(shù)、徑向基核函數(shù)和神經(jīng)元的非線性作用函數(shù)核函數(shù)對(duì)大豆油中磷脂含量的化學(xué)值和電化學(xué)數(shù)據(jù)建立回歸校正模型，然后將預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值進(jìn)行對(duì)比，分析計(jì)算其誤差。經(jīng)研究，基于神經(jīng)元的非線性作用函數(shù)核函數(shù)的支持向量機(jī)回歸建模效果很差，所以之后將不再進(jìn)行討論，建模效果評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)比見(jiàn)表3。

表3 建模效果評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)比Table3 Comparison of prediction performances of regression models

由表3可以看出，主成分回歸模型建立效果比直線擬合差，偏最小二乘回歸及支持向量機(jī)回歸模型建立效果均優(yōu)于直線擬合模型。經(jīng)分析比較可知，基于徑向基核函數(shù)支持向量機(jī)回歸方法建立回歸校正模型對(duì)未知樣品的預(yù)測(cè)效果最佳，支持向量機(jī)回歸（徑向基核函數(shù)）的回歸預(yù)測(cè)模型如圖4所示。

圖4 支持向量機(jī)回歸（徑向基核函數(shù)）回歸預(yù)測(cè)模型Fig.4 SVMR prediction model (based on radial basis function)

基于徑向基核函數(shù)的支持向量機(jī)回歸對(duì)電化學(xué)數(shù)據(jù)與磷脂含量標(biāo)準(zhǔn)值建立的回歸校正模型對(duì)未知樣品預(yù)測(cè)效果最佳，樣本均分布在擬合線附近，其模型的決定系數(shù)R2為0.998 7，預(yù)測(cè)均方根誤差為0.288 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.55%，可以滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)要求。

3 結(jié) 論

利用多重修飾的酶電極采集不同磷脂含量的大豆油樣本的電化學(xué)循環(huán)伏安曲線，通過(guò)去噪處理使循環(huán)伏安曲線的還原峰電流與大豆油中的磷脂含量進(jìn)行直線擬合。再分別利用主成分回歸、偏最小二乘回歸和支持向量機(jī)回歸4 種方法根據(jù)其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)值建立回歸預(yù)測(cè)模型，研究發(fā)現(xiàn)基于徑向基核函數(shù)的支持向量機(jī)回歸模型預(yù)測(cè)效果最佳，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)均達(dá)到預(yù)期效果，滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)要求。本研究可為實(shí)現(xiàn)油脂中磷脂實(shí)時(shí)有效的在線檢測(cè)提供理論依據(jù)。