李 路，呂燕霖，郭偉靈，潘雨陽，洪家麗，趙立娜，倪 莉，饒平凡，李秋藝，呂旭聰,,

（1.福建農林大學 國家菌草工程技術研究中心，福建 福州 350002；2.泉州經貿職業(yè)技術學院，福建 泉州 362000；3.福州大學食品科學技術研究所，福建 福州 350108；4.福州外語外貿學院，福建 福州 350202）

黃酒是世界上最古老的發(fā)酵型酒精飲料之一[1]，富含氨基酸，具有獨特的香氣和低酒精含量，深受人們的喜愛[2]。酒曲是黃酒釀造的動力，具有糖化、發(fā)酵和生香三大功能，對黃酒風味組分的形成起到至關重要的作用[3-4]。作為中國黃酒中頗具特色的典型代表，紅曲黃酒是以糯米為主要原料，添加紅曲和白曲作為糖化發(fā)酵劑，經多種微生物釀造而成的一種低度黃酒，以色紅、味醇、香濃而著稱[5-6]。紅曲又稱丹曲，主要是以大米為原料經紅曲霉等微生物發(fā)酵而制成的一種米曲[7-8]。白曲是以米粉或米糠為原料，添加少量中草藥接入曲母培養(yǎng)而成，它是以根霉和酵母菌為主的酒曲[9]。紅曲黃酒獨特揮發(fā)性風味組分的形成與酒曲中的微生物發(fā)揮的功能密切相關[10]。然而，至今為止，紅曲和白曲中的微生物菌群及揮發(fā)性風味組分尚不明確。課題組前期研究發(fā)現紅曲和白曲對紅曲黃酒揮發(fā)性風味組分形成存在顯著差異，由此推測該差異可能與紅曲和白曲中的微生物菌群及其揮發(fā)性風味組分有關。本研究采用頂空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）聯(lián)用技術分析紅曲和白曲的揮發(fā)性風味組分，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）模型確定紅曲和白曲中的特征揮發(fā)性風味組分；同時，通過高通量測序分析紅曲和白曲中微生物菌群結構，確定紅曲和白曲中的優(yōu)勢微生物菌群結構。研究結果將為提升紅曲黃酒風味和改良紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造工藝提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲、藥白曲 當地紅曲黃酒釀造酒廠；2-辛醇（內標，色譜純） 美國Sigma公司；NaCl（分析純）國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產色譜純或分析純。

1.2 儀器與設備

7890A/5975MSD型GC-MS聯(lián)用儀、DB-5MS彈性石英毛細管管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；SPME裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；15 mL頂空鉗口樣品瓶上海安譜公司；電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DF-1型號集熱式磁力攪拌器 金壇市鑫渃實驗儀器廠；QYSW-10B純水機 重慶前沿水處理設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME

萃取頭的預處理：將新購置的萃取頭插入氣相色譜儀（進樣口250 ℃）老化1 h。

樣品HS-SPME：稱取2.0 g NaCl加入到15 mL的鉗口樣品瓶中，加入0.6 g樣品（研磨后）與5.4 mL超純水混勻，再加入5 μL內標溶液（2-辛醇質量濃度為10 mg/L），用封蓋器封好。50 ℃磁力攪拌器上預熱10 min后，將萃取頭插入樣品瓶頂空部分，50 ℃萃取30 min。

1.3.2 GC-MS分析香氣組分

將萃取頭從頂空瓶中取出，迅速插入氣相色譜儀進樣口，250 ℃解吸5 min，進行GC-MS檢測分析。氣相色譜條件：高純度氦氣作為載氣，流速：1 mL/min；色譜柱：DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣模式：不分流進樣；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至120 ℃，然后以10 ℃/min升至240 ℃，保留5 min；后運行溫度：240 ℃；后運行時間：5 min。質譜條件：接口溫度：280 ℃；連接桿溫度：150 ℃；電子離子源：電子能量70 eV；離子源溫度：230 ℃；質量掃描范圍：m/z 35～450；ACQ方式：Scan。

1.3.3 GC-MS數據分析

定性和定量分析：由GC-MS得到的色譜圖，經計算機在標準譜庫NIST11和Wiley中比對檢索，確定揮發(fā)性組分的化學成分，并準確地鑒定出紅曲和白曲的揮發(fā)性成分，同時采用2-辛醇（10 mg/L）為內標進行進行半定量分析，得到各組分的質量濃度。利用R語言繪制熱圖，可直觀觀察到紅曲和白曲揮發(fā)性風味組分含量的差異。將處理后的數據進一步通過SIMCA 14.1軟件進行多變量分析處理。進行PCA檢測兩組紅曲和白曲樣品的聚類趨勢。通過OPLS-DA模型快速準確地篩選出紅曲和白曲樣品中的差異揮發(fā)性風味組分。

1.3.4 酒曲微生物總DNA提取

紅曲和白曲樣品凍干后各取10 g研磨，分別加入90 mL超純水混勻，用4 層紗布過濾后保留各自上清液，利用低溫離心機離心（8 000 r/min、4 ℃、10 min），收集沉淀（菌體）。將收集的菌體利用OMEGA公司試劑盒Mag-Bind Soil DNA Kit (50) M5635-01提取菌體DNA。

1.3.5 微生物菌群高通量測序及數據分析

采用細菌引物Pro340F（5’-CCTACGGGNBGCASCAG-3’）和Pro805R（5’-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3’）對細菌菌群16S的V3-V4高變區(qū)進行擴增[11]；采用真菌引物ITS2F（5’-GTGAATCATCGARTC-3’）和ITS2R（5’-TCCTCCGCTTATTGAT-3’）對真菌菌群ITS2區(qū)域進行擴增[12]。將擴增產物送至上海派森諾生物科技有限公司進行高通量測序。測序結果采用Qiime軟件分析，將序列歸類、去除標簽、引物和接頭序列，并且去除長度小于110 bp、模糊堿基大于2和序列平均質量小于30的序列，最后使用UCLUST把高質量的序列根據97%序列相似度聚成不同的操作性分類單元，分析鑒定不同釀造用曲中的微生物菌群分布[13-16]。

2 結果與分析

2.1 紅曲和白曲樣品中揮發(fā)性風味組分的測定

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對紅曲和白曲樣品中的揮發(fā)性風味組分進行HS-SPME結合GC-MS分析，其總離子流色譜圖見圖1。

圖1 白曲（a）和紅曲（b）中揮發(fā)性組分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in Baiqu (a) and Hongqu (b)

通過數據庫的比對，鑒定出紅曲和白曲樣品中的揮發(fā)性組分共70 種，并用R語言繪制成熱圖，可以直觀地顯示兩種樣品揮發(fā)性風味組分的差異。由圖2可知，紅曲和白曲樣品分別有48 種和40 種，其中，有24 種是2 種酒曲共有的揮發(fā)性風味組分，如異戊醇（F3）、正己醇（F7）、己醛（F53）等；28 種是紅曲樣品特有，如草蒿腦（F48）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（F66）、2-甲酚（F64）等；18 種是白曲樣品特有，如2-乙基己醇（F8）、2-庚醇（F18）和2-壬酮（F23）等。

圖2 紅曲和白曲中揮發(fā)性風味組分的熱圖分析Fig.2 Heat-map analysis of volatile components in Hongqu and Baiqu

2.2 紅曲和白曲揮發(fā)性風味組分PCA

PCA是一種無監(jiān)督的多元變量統(tǒng)計分析方法，可以從多維空間反映各組樣本之間的代謝差異和組間樣本差異，是原始數據最初呈現的一種基本原始狀態(tài)[17-19]。從圖3可以看出，兩組樣本區(qū)分非常顯著，且樣本均處于95%置信區(qū)間內。

圖3 基于PCA解析紅曲和白曲的揮發(fā)性風味組分Fig.3 PCA of volatile flavor components in Hongqu and Baiqu

2.3 紅曲與白曲中揮發(fā)性風味組分的差異分析

圖4 紅曲和白曲揮發(fā)性風味組分OPLS-DA模型的置換檢驗結果Fig.4 Permutation test of OPLS-DA model for volatile flavor components in Hongqu and Baiqu

圖5 紅曲和白曲揮發(fā)性風味組分OPLS-DA的分數散點圖Fig.5 Score scatter plot based on OPLS-DA model for volatile flavor components in Hongqu and Baiqu

在OPLS-DA模型中，兩組之間的分類可以采用分數散點圖和S型載荷圖的形式進行可視化。通過OPLSDA，可獲取更加可靠的代謝物組間差異與實驗組的相關程度信息，而構建模型的可信度通過置換檢驗得出[20]。如圖4所示，橫坐標表示置換檢驗的置換保留度（置換保留度等于1處的點即為原模型的R2和Q2值），R2接近1，說明建立的模型符合樣本數據的真實情況；Q2接近1，說明如果有新樣本加入模型，會得到近似的分布情況[21-22]。由此，從分數散點圖（圖5）可見，紅曲與白曲兩組樣本區(qū)別非常顯著，樣本全部處于95%置信區(qū)間內。

圖6 基于OPLS-DA模型分析的S型載荷圖Fig.6 S-shaped loading plot based on OPLS-DA model analysis

圖7 基于OPLS-DA模型分析的VIP預測值分布圖Fig.7 Distribution of VIP forecast values based on OPLS-DA model analysis

S型載荷圖通過組合OPLS-DA預測模型組件的協(xié)方差分布和權重的相關性來改善分類變量的可視化，具有較高相關值和協(xié)方差的物質與原點相距較遠，表示差異較大[23]。通過OPLS-DA模型第1主成分的變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）大于1，來篩選紅曲與白曲之間具有顯著差異的揮發(fā)性風味物質（圖6、7）。

紅曲與白曲之間顯著差異的揮發(fā)性風味物質有18種，其中相比較白曲，紅曲中的特征揮發(fā)性風味物質為：2-壬酮（F23）、2-庚酮（F19）、2-庚醇（F18）、2-乙基己醇（F8）、2-壬醇（F22）、4-甲基-1,6-庚二烯-4-醇（F34）、乙酸乙酯（F49）、N-羥基苯甲酰亞胺甲酯（F60）；而相比較紅曲，白曲中的特征揮發(fā)性風味物質為：丁子香酚（F51）、草蒿腦（F48）、苯乙醇（F67）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（F66）、己醛（F53）、苯甲醛（F40）、正己醇（F7）、異戊醇（F3）、2-甲酚（F64）和（±）-1-苯乙醇（F42）。

2.4 紅曲和白曲中的微生物菌群結構分析

2.4.1 細菌菌群結構分析

表1 紅曲和白曲中的細菌組成比例Table1 Bacterial community composition of Hongqu and Baiqu

由表1可知，紅曲中的優(yōu)勢細菌菌群為芽孢桿菌屬（62.791%）、魏斯氏菌屬（6.944%）、片球菌屬（17.290%）、葡糖醋桿菌屬（2.931%）等，其中葡糖醋桿菌屬、細球菌科、葡糖桿菌屬等為紅曲特有菌群。芽孢桿菌屬具有較強的分泌蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等酶類的能力，可分解大分子物質形成雙乙酰、含氮化合物等芳香物質，對黃酒風味物質的形成有巨大的貢獻作用[24]。劉蕓雅等[25]通過對紹興黃酒發(fā)酵中微生物群落結構研究時，同樣發(fā)現芽孢桿菌屬與乙酸己酯相關性極強。白曲中的優(yōu)勢細菌菌群為泛生菌屬（34.749%）、腸桿菌屬（29.680%）、魏斯氏菌屬（21.609%）、克雷白氏桿菌屬（7.199%）和阪崎腸桿菌屬（2.063%）等，其中而阪崎腸桿菌屬、腸桿菌科、變形桿菌屬和檸檬酸桿菌屬則為白曲特有菌群。腸桿菌屬細菌多為不致病菌或條件致病菌，但有部分是人體內的正常微生物，能夠產生短鏈脂肪酸和有機酸并能利用糖酵解和戊糖磷酸途徑對糖進行降解[26]。

2.4.2 真菌菌群結構分析

表2 紅曲和白曲中的真菌組成比例Table2 Fungal community composition Hongqu and Baiqu

如表2所示，在紅曲中的優(yōu)勢真菌菌群為黑曲霉（74.157%）、紫紅曲霉（22.827%）、黃曲霉（2.716%）和釀酒酵母（0.198%）等，特有的菌群為膜醭畢赤酵母和瓜笄霉；而白曲中的優(yōu)勢真菌菌群為釀酒酵母（69.976%）、少根根霉（13.550%）、印度毛霉（9.094%）、亮白曲霉（2.533%）等，特有的菌群為亮白曲霉、小孢根霉、伯頓絲孢畢赤酵母、卵形絲孢酵母、帚狀曲霉和叢赤殼科等。由于根霉含有豐富的糖化型淀粉酶，能將大米淀粉結構中的α-1,4鍵和α-1,6鍵切斷，促進絕大部分淀粉轉化為可發(fā)酵糖，因此在白曲中的少根根霉和小孢根霉具有提高糖化率和淀粉利用率的作用[27-28]。釀酒酵母在釀酒過程中，將可發(fā)酵性糖分轉化為乙醇及二氧化碳的同時伴隨著大量副產物的生成，如醇類、醛酮類、酸類、酯類、含硫化物等，這些副產物形成了黃酒風味的主體成分[29-30]。此外，余培斌[31]也發(fā)現曲霉屬、芽孢桿菌屬、根霉屬等是產生生淀粉葡萄糖淀粉酶的主要優(yōu)勢菌群，對釀酒產生各種風味物質具有重要的作用。

3 結 論

HA-SPME結合GC-MS、PCA和OPLS-DA實驗結果表明：從紅曲與白曲中檢測到的揮發(fā)性物質共70 種，紅曲與白曲之間顯著差異的揮發(fā)性風味物質有18 種，其中紅曲中的特征揮發(fā)性風味物質包括2-壬酮、2-庚酮、2-庚醇、2-乙基己醇、2-壬醇、4-甲基- 1,6-庚二烯-4-醇、乙酸乙酯和N-羥基苯甲酰亞胺甲酯，而白曲中的特征揮發(fā)性風味物質包括丁子香酚、草蒿腦、苯乙醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚、己醛、苯甲醛、正己醇、異戊醇、2-甲酚和（±）-1-苯乙醇。菌群高通量測序結果表明：紅曲中的優(yōu)勢細菌主要是芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、片球菌屬、葡糖醋桿菌屬、細球菌科和芽孢桿菌科等，優(yōu)勢真菌主要是黑曲霉、紫紅曲霉、黃曲霉和釀酒酵母等；白曲中的優(yōu)勢細菌主要是泛生菌屬、腸桿菌屬、魏斯氏菌屬、克雷白氏桿菌屬、阪崎腸桿菌屬和大腸桿菌志賀菌屬等，優(yōu)勢真菌主要是釀酒酵母、少根根霉、印度毛霉、亮白曲霉、小孢根霉和布拉特假絲酵母等。研究分析了紅曲和白曲中微生物菌群及揮發(fā)性風味組分，對進一步解析紅曲黃酒產香機理和提升紅曲黃酒的風味品質都具有重要的理論指導價值。