趙 雯，吳鳳玉，鄭 義，張 健，姜蕓云，趙 笑，楊貞耐

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京工商大學，北京 100048）

益生菌冰淇淋是在冰淇淋原本美味的基礎上，進一步賦予產(chǎn)品良好的腸道益生特性，因此廣受歡迎，是冷飲市場近年研究與開發(fā)的熱點。益生菌冰淇淋自1970年在美國上市以來，其銷量占比已經(jīng)超過了冷飲市場總體的25%，而中國益生菌冰淇淋銷量預計將達到100億 元市場規(guī)模[1]。

冰淇淋配料種類豐富，可以為益生菌提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)如乳蛋白、乳脂肪、乳糖、維生素等，并且具有較為溫和的pH值環(huán)境，因此被認為是良好的益生菌傳遞載體[2]。然而，冰淇淋制作過程需要低溫凝凍，運輸過程中不可避免的凍融循環(huán)以及長時間低溫貯藏都會對菌體造成冷凍損傷[3]。低溫環(huán)境下，菌體對碳水化合物與氨基酸的利用能力下降，細胞膜的流動性下降，膜相關功能受損，RNA形成穩(wěn)定的二級結構，蛋白質(zhì)合成速率減緩，對冰淇淋中活菌數(shù)和菌活性的保持產(chǎn)生不利影響[4]。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，冰淇淋經(jīng)凝凍過程和4 周低溫冷凍貯藏后，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YW11活菌數(shù)下降0.8～1.61 個數(shù)量級，耐酸和膽鹽的特性也隨之下降[5]。世界衛(wèi)生組織對益生菌產(chǎn)品的定義為食品中含有充足數(shù)量的活的微生物，經(jīng)過食品加工的各個過程，以及進入人體腸道以后，仍能保持適當?shù)幕罹鷶?shù)量和菌活性[6]。研究指出益生菌產(chǎn)品若想達到其預期的功能特性，益生菌活菌數(shù)在產(chǎn)品貨架期內(nèi)應保持在106～107CFU/g范圍內(nèi)[7]。在巴西，法律規(guī)定，活菌數(shù)應在108～109CFU/g范圍內(nèi)才可以在產(chǎn)品標簽上標注為含有益生菌食品[8]。因此如何保持菌株在冰淇淋產(chǎn)品生產(chǎn)加工及貯存過程中的活菌數(shù)和菌活性，成為目前亟待解決的問題。

多種策略應用于如何保護菌株以緩解低溫脅迫對其體造成的傷害，如脅迫預處理、添加巧克力等保護因子、微膠囊包埋技術、優(yōu)化冰淇淋配料組成及產(chǎn)品加工工藝等[9-11]。其中脅迫預處理會誘使菌體進化出特定的脅迫-敏感系統(tǒng)以及脅迫-防御機制，使得菌體可以耐受長期不利的環(huán)境條件或突然的環(huán)境改變[12-13]。冷激蛋白（cold-shock protein，CSP）家族是微生物在低溫環(huán)境下誘導產(chǎn)生的一類重要分子伴侶家族，參與轉錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊等一系列過程[14]。進一步研究表明，細菌在應對高溫脅迫環(huán)境時，會誘導出與低溫脅迫相似的代謝通路與蛋白質(zhì)合成變化，產(chǎn)生交互保護作用而提高菌株的低溫耐受性[15]。巧克力中含有豐富的可可脂成分，可在菌體周圍形成保護層，進而對外界脅迫環(huán)境起到緩沖作用，并且有助于益生菌在腸道中的靶向釋放[16]。Silva等[17]使用巧克力作為L. acidophilus LA3和Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLC1的傳遞載體，其活菌數(shù)在4 ℃貯存120 d后沒有發(fā)生明顯變化。Kemsawased等[18]使用巧克力作為L. casei 01和L. acidophilus LA5的固定化載體，其活菌數(shù)在4 ℃貯存60 d后大于106CFU/g，并且具有較為良好的模擬腸道環(huán)境耐受性。

本研究利用1 株分離自西藏靈菇的益生性植物乳桿菌K25，將其加入到冰淇淋漿料中，發(fā)酵制備益生菌冰淇淋。前期實驗表明，植物乳桿菌K25能夠提高衰老小鼠的抗氧化能力，降低小鼠血清膽固醇水平，抑制口腔變異鏈球菌；進一步對K25菌株全基因組測序及蛋白質(zhì)組學的研究表明，該菌株具有與低溫耐受相關的基因及蛋白質(zhì)表達[19-20]；此外K25菌株具有良好的胃酸和膽鹽耐受性，適宜用于冰淇淋的發(fā)酵制作。本研究考察低溫和高溫脅迫預培養(yǎng)菌株及添加巧克力輔料的方法，對冰淇淋中益生性植物乳桿菌K25生物活性和腸道環(huán)境耐受性的保護作用，以及溫度脅迫預培養(yǎng)后的菌株對冰淇淋品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌K25由吉林省農(nóng)業(yè)科學院提供，菌株保存在含20%甘油的MRS培養(yǎng)基中，－80 ℃凍存。使用前接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃連續(xù)活化3 次。

大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、乙酸、瓊脂、吐溫8.0（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；脫脂乳粉 新西蘭恒天然集團有限公司；奶油雀巢股份有限公司；巧克力醬 費列羅股份有限公司。

MRS瓊脂培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐溫80 1.0 mL/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、檸檬酸鈉5.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.054 g/L、瓊脂15 g/L，蒸餾水1 000 mL，1 mol/L乙酸調(diào)pH值為6.5，121℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

GJJ-0.03/100小型實驗室均質(zhì)機 上海諾尼輕工機械有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器 日本三洋公司；BQ7225軟質(zhì)冰淇淋機 黃石東貝制冷有限公司；DV-II黏度計 英國Brookf i eld公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫及高溫脅迫預處理對植物乳桿菌K25低溫耐受性的影響

采用不同溫度條件對處于對數(shù)生長期的植物乳桿菌K25進行脅迫預處理，具體方法參照Ergin等[21]，稍作改動。分別采取低溫4、10、20 ℃和高溫45、50、55 ℃脅迫處理0.5、1.5、3、5、8、18、24 h。脅迫預處理后的菌株分為4 部分貯存。一部分于MRS固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)72 h測定初始活菌數(shù)，剩余3 部分則貯藏于－20 ℃，分別在1、15、30 d測定其活菌數(shù)變化。未經(jīng)處理的植物乳桿菌 K25（對照）采取相同方法測定其活菌數(shù)變化。

1.3.2 C-K25與H-K25制作巧克力冰淇淋

圖1 冰淇淋制作流程Fig.1 Flow chart of ice cream production process

分別選用低溫（cold adapted-K25，C-K25）和高溫（heat adapted-K25，H-K25）處理組中終活菌數(shù)最高的兩株菌用于冰淇淋制作，使用未經(jīng)處理的植物乳桿菌K25作對照組。冰淇淋具體制作方式如圖1所示。

1.3.3 冰淇淋理化性質(zhì)分析

1.3.3.1 滴定酸度和pH值

滴定酸度測定參照于志會等[22]方法，略作修改。取10 g冰淇淋漿料樣品，加入20 mL去離子水，充分混勻，加入2 滴酚酞指示劑，用濃度為0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定。滴定酸度為1 g冰淇淋漿料消耗濃度為0.1 mol/L NaOH溶液的毫升數(shù)，消耗1 mL濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液相當于1 °T。pH值采用pH計測定。

1.3.3.2 膨脹率

分別稱取100 mL冰淇淋漿料質(zhì)量M1和冰淇淋成品質(zhì)量M2，測定其膨脹率，按照式（1）計算：

1.3.3.3 融化率

稱取25 g于－20 ℃貯存30 d冰淇淋成品，置于0.833 mm的不銹鋼篩網(wǎng)上，在溫度25 ℃、相對濕度75%的環(huán)境下靜置1 h，每隔10 min稱其融化質(zhì)量，按式（2）計算融化率：

1.3.3.4 黏度

采用布氏黏度儀測定老化后的冰淇淋漿料黏度。將－20 ℃冷凍的冰淇淋樣品于4 ℃緩慢解凍，用玻璃棒將冰淇淋樣品輕輕攪拌均勻（順時針和逆時針各攪拌10 圈），選用LV34轉子，測定條件為5 r/min，每隔5 s取一個測試值，測定時間范圍為0～120 s。

1.3.3.5 硬度

冰淇淋樣品在－20 ℃冰箱貯存48 h后，采用Texture Analyzer XT2質(zhì)構儀進行硬度測定，P/5 Cylinder stainless探頭，直徑0.5 cm，測定速率1 mm/s，刺入深度0.5 cm。

1.3.4 冰淇淋中植物乳桿菌K25活菌數(shù)的測定

采用平板涂布計數(shù)法測定冰淇淋冷藏期間的活菌數(shù)。取5 g冰淇淋樣品，45 mL無菌生理鹽水稀釋。取稀釋后的樣品溶液1 mL，梯度稀釋后，取適宜的稀釋液倍數(shù)接種于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，記錄各組冰淇淋樣品漿料－20 ℃貯存1、15、30、60 d后活菌數(shù)變化。

1.3.5 冰淇淋中植物乳桿菌K25模擬胃腸道耐受性實驗

?。?0 ℃貯存30 d的冰淇淋樣品，測定植物乳桿菌K25在體外模擬胃腸道環(huán)境下的存活能力。植物乳桿菌K25對人工模擬胃液、腸液的耐受性測定方法參照Buriti等[23]方法，略作改動。取冰淇淋樣品25 g，使用22 mL 0.05 g/L NaCl溶液稀釋后混合均勻制成樣品溶液。人工模擬胃液：取10 mL樣品溶液，0.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 2.6～3.0，加入0.3 mL 3 mg/mL胃蛋白酶溶液，充分混勻后，37 ℃培養(yǎng)2 h，MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h測定活菌數(shù)。人工模擬胰液：取10 mL樣品溶液，1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 4.9～5.4。加入膽鹽與胰酶分別至終質(zhì)量濃度6、1 mg/mL，充分混勻后37 ℃培養(yǎng)2 h，MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h測定活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)，圖表在Origin 7.5中生成，所有組別數(shù)據(jù)均測定3 次后取平均值，ANOVA進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同溫度脅迫預處理對植物乳桿菌K25低溫耐受性的影響

圖2 不同溫度脅迫－20 ℃處理活菌數(shù)變化Fig.2 Change in viable counts of L. plantarum K25 during storage at -20 ℃

如圖2所示，所有組別的植物乳桿菌K25初始活菌數(shù)大致相同（108CFU/mL），低溫脅迫1.5～24 h范圍內(nèi)，植物乳桿菌K25初始活菌數(shù)均略有增長，相反，熱處理超過8 h后檢測不到活菌數(shù)，表明植物乳桿菌K25不能耐受長時間高溫環(huán)境。

植物乳桿菌K25在－20 ℃環(huán)境下貯存30 d后，其活菌數(shù)由最初的108CFU/mL降至104CFU/mL。圖2 A～C顯示，貯存1 d后，活菌數(shù)保持在1.12×107～1.2×108CFU/mL范圍內(nèi)，貯存30 d后，活菌數(shù)在1.5×104～1.10×106CFU/mL范圍內(nèi)，其中以貯存時間為15 d時，其活菌數(shù)下降幅度明顯。10 ℃-18 h、10 ℃-24 h組凍藏30 d后其活菌數(shù)分別為1.14×105CFU/mL和2.20×105CFU/mL，而4 ℃-18 h組終活菌數(shù)最高1.10×106CFU/mL，為對照組活菌數(shù)的12 倍。圖2D～F顯示，貯存1 d后，活菌數(shù)保持在1.24×108～8.0×108CFU/mL。4 5℃-0.5 h組在－2 0 ℃貯存3 0 d后其活菌數(shù)為5.4×105CFU/mL，而55 ℃-0.5 h組終活菌數(shù)最高，為1.35×106CFU/mL，為對照組活菌數(shù)的15 倍。Wouters等[24]研究表明，L. lactis MG1363在10 ℃預先處理4 h后，于－20 ℃環(huán)境下貯存24 h菌株存活率增加約100 倍。Walker等[25]研究指出L. johnsonii VPI 11088在55 ℃脅迫預處理30 min后在－20 ℃貯存7 d，其活菌數(shù)與對照組相比增加了20%。Shao Yuyu等[26]研究指出，亞致死溫度脅迫預處理誘導CSP編輯基因（cspA、cspB、cspC、cspD、cspE、cspF）過表達，該家族基因表達能夠提高菌株低溫耐受性。Komatsu等[27]則進一步證明熱脅迫處理條件下誘導產(chǎn)生的熱激蛋白同樣可以增加細胞的冷凍耐受性，該蛋白可通過與大分子物質(zhì)疏水相互作用進而增加其穩(wěn)定性以發(fā)揮保護作用。Kandil等[28]則認為溫度預處理能夠提高菌株低溫耐受性主要源于不同溫度下酶構象和活性的改變。

在所有溫度時間相互作用關系中，4 ℃-18 h與55 ℃-0.5 h脅迫預處理后植物乳桿菌K25在－20 ℃貯存30 d內(nèi)降幅最小、終活菌數(shù)最高，活菌數(shù)分別由8.16（lg（CFU/mL））降至5.96（lg（CFU/mL））、9.25（lg（CFU/mL））降至6.13（lg（CFU/mL）），分別降低2.2、3.12 個對數(shù)級，對照組則由8.25 （lg（CFU/mL））降低至4.60（lg（CFU/mL）），降低3.65 個對數(shù)級。4 ℃-18 h與55 ℃-0.5 h脅迫預處理后植物乳桿菌K25在－20 ℃貯存30 d后的活菌數(shù)與未經(jīng)處理的菌株相比分別提高了18.2%與10.4%，因此選用該2 種脅迫處理后的K25菌株用作冰淇淋的加工制作。

2.2 冰淇淋產(chǎn)品理化指標分析

表1 冰淇淋理化性質(zhì)測定結果Table1 Physicochemical properties of ice cream fermented with cold-/heat- adapted L. plantarum K25

冰淇淋產(chǎn)品的酸度、膨脹率、融化率、黏度、硬度是影響產(chǎn)品口感與消費者感官的主要理化因素[29]，本實驗對冰淇淋產(chǎn)品理化指標的測定結果如表1所示。相同發(fā)酵時間內(nèi)，不同組別的冰淇淋pH值、滴定酸度、膨脹率和融化率變化分別在5.82～6.11、30～45 °T、19.46%～44.93%、13.17～19.00 g/min范圍內(nèi)。其中溫度脅迫處理后的K25發(fā)酵冰淇淋pH值較低，可能歸因為脅迫處理影響了菌株的代謝通路，促進菌體產(chǎn)酸[14]。而C-K25組發(fā)酵冰淇淋膨脹率較高（35.81%）且融化率較低（14.67 g/min），具有良好的冰淇淋理化特性。不同組別的冰淇淋在黏度與硬度變化分別在707～1 079 mPa·s和728～1 156 N范圍內(nèi)，差異較為顯著（P＜0.05）。經(jīng)脅迫處理后的植物乳桿菌K25發(fā)酵冰淇淋黏度、硬度均高于未處理組。不同組別理化性質(zhì)的差別可能歸因于脅迫環(huán)境下，菌株分泌過量的胞外多糖等代謝產(chǎn)物以保護菌體，這些代謝產(chǎn)物會對冰淇淋產(chǎn)品的黏度和硬度產(chǎn)生影響。Van Laere等[30]指出在亞致死高溫脅迫下，與胞外多糖合成相關的半乳糖酶活性明顯增強，進而促進胞外多糖的分泌。Nguten等[31]進一步指出胞外多糖黏附在細胞表面，降低細胞表面凈電荷，進而增加其對不良環(huán)境的耐受性。Dertli等[32]研究則表明，與不產(chǎn)胞外多糖的菌株相比，使用產(chǎn)胞外多糖的菌株發(fā)酵冰淇淋，產(chǎn)品具有更高的黏度。Ergin等[21]使用溫度脅迫預處理后的菌株發(fā)酵冰淇淋，其產(chǎn)品的黏度與硬度增加，將其解釋為產(chǎn)品中菌株活性增加引起的胞外多糖產(chǎn)量增加。

2.3 植物乳桿菌K25發(fā)酵冰淇淋的活菌數(shù)變化

表2 低溫和高溫脅迫處理后的植物乳桿菌K25發(fā)酵冰淇淋于－20 ℃貯存60 d后的活菌數(shù)變化Table2 Viable counts of cold-/heat- adapted L. plantarum K25 in ice cream during storage for 60 days at-20 ℃（lg（CFU/mL））

保持菌株在產(chǎn)品冷凍加工過程以及貨架期期間的活菌數(shù)和生物活性對冰淇淋產(chǎn)品的益生特性具有顯著意義。不同組別冰淇淋漿料及－20 ℃貯存60 d內(nèi)的活菌數(shù)變化如表2所示，植物乳桿菌K25發(fā)酵冰淇淋初始活菌數(shù)為8.48（lg（CFU/mL））。L. acidophilus、B. lactis Bb12、L. casei發(fā)酵冰淇淋的初始活菌數(shù)分別為7.36、7.45、6.49（lg（CFU/mL））[33-36]。結果表明，植物乳桿菌K25具有較為良好的冰淇淋基質(zhì)發(fā)酵特性，適宜作為冰淇淋的發(fā)酵菌株或輔助發(fā)酵劑以提高產(chǎn)品中的活菌數(shù)。硬化過程活菌數(shù)下降最為明顯，1 d后下降至7.52（lg（CFU/mL））（下降0.96 個對數(shù)級）。Zhang Jian等[5]對植物乳桿菌YW11發(fā)酵冰淇淋從加工到貯存期間的活菌數(shù)變化情況進行探討，結果表明硬化過程對活菌數(shù)影響最大。L. acidophilus La-5和B. animalis Bb-1在冰淇淋凝凍過程中，其活菌數(shù)同樣顯著降低[35]。而Leandro等[36]研究則指出冰淇淋硬化過程對L. delbrueckii UFV H2b20活菌數(shù)影響較小。Ferraz等[11]指出凝凍對活菌數(shù)的影響主要與冰淇淋產(chǎn)品的脂肪含量與膨脹率相關。

植物乳桿菌K25發(fā)酵冰淇淋，從漿料至60 d貯存過程中，其終活菌數(shù)為5.63（lg（CFU/mL）），平均活菌數(shù)為6.8 3（l g（C F U/m L）），活菌數(shù)下降2.8 5 個對數(shù)級。其中 H-K 2 5 組發(fā)酵冰淇淋從漿料至6 0 d貯存過程中，終活菌數(shù)為7.2 6（l g（C F U/m L）），平均活菌數(shù)為7.7 9（l g（C F U/m L）），活菌數(shù)下降1.2 7 個對數(shù)級。C-K 2 5發(fā)酵冰淇淋從漿料至貯存過程中，其終活菌數(shù)為7.3 2（l g（C F U/m L）），平均活菌數(shù)為7.8 9（l g（C F U/m L）），活菌數(shù)下降1.36 個對數(shù)級。結果表明經(jīng)過高溫、低溫脅迫預處理后的菌株，在冰淇淋發(fā)酵及貯存期間，其終活菌數(shù)分別提高1.63、1.69 個對數(shù)級。除對照組外，所有組別的冰淇淋活菌數(shù)在經(jīng)60 d貯存后，均高于106CFU/mL，滿足益生菌產(chǎn)品對活菌數(shù)的最基本要求。Arslan等[37]研究指出，通過分級冷凍的方式對菌株進行預處理，在冰淇淋發(fā)酵、加工和貯存過程，菌體細胞對冷凍條件耐受性增強。Zhang Jian等[5]指出與直接添加菌株發(fā)酵冰淇淋的方式相比，添加冷凍干燥后的菌粉進行冰淇淋制作，冰淇淋產(chǎn)品在發(fā)酵和貯存過程中活菌數(shù)保持較為穩(wěn)定。這一方面歸因于冷凍干燥過程添加的保護劑對菌株具有一定程度的保護作用，另一方面則歸因于冷凍條件改變菌株胞內(nèi)酶活性，使其能夠更好地適應冷凍條件。有研究[21,38]采取低溫和高溫對L. acidulous進行脅迫預處理，并使用脅迫后的菌株制作冰淇淋，結果表明冰淇淋在冷凍貯藏120 d后，脅迫處理后的菌株的菌活數(shù)明顯高于空白組。Chen Mingju等[39]表明熱脅迫、冷脅迫預處理均可以提高L. kef i ranofaciens M1的低溫耐受特性，并進一步提高該菌株的腸道環(huán)境耐受性。

K25-巧組冰淇淋從漿料至60 d貯存過程中，其終活菌數(shù)為6.04（lg（CFU/g）），平均活菌數(shù)為7.04（lg（CFU/mL）），活菌數(shù)下降2.47 個對數(shù)級。H-K25-巧組（添加巧克力）冰淇淋從漿料至60 d貯存過程中，其終活菌數(shù)為7.40（lg（CFU/mL）），平均活菌數(shù)為7.86（lg（CFU/mL）），活菌數(shù)下降1.16 個對數(shù)級。C-K25-巧組（添加巧克力）冰淇淋從漿料至60 d貯存過程中，其終活菌數(shù)為7.56（lg（CFU/mL）），平均活菌數(shù)為7.97（lg（CFU/mL）），活菌數(shù)下降1.07 個對數(shù)級。終活菌數(shù)與相應的未添加巧克力組分別提高了0.41、0.26、0.24 個對數(shù)級，表明巧克力的添加對菌株具有一定的保護作用。Possemiers等[40]使用巧克力作為L. helveticus CNCM I-1722和B. longum CNCM I-3470的微膠囊載體，制作益生菌冰淇淋，菌株在冷凍貯存期間活菌數(shù)穩(wěn)定性增加，經(jīng)體外模擬胃酸與膽汁消化后，活菌數(shù)分別保持91%和80%。Champagne等[41]將巧克力加入L. rhamnosus R0011和B. longum R0175微膠囊壁材中制作益生菌冰淇淋，低溫貯存24 周，其存活率高于未加巧克力的包埋組與未包埋組。2.4 耐酸耐膽鹽結果

表3 人工模擬胃酸和膽鹽環(huán)境對冰淇淋中不同溫度脅迫處理植物乳桿菌K25活菌數(shù)的影響Table3 Viable counts of cold-/heat-adapted L. plantarum K25 in ice cream during exposure to simulated gastric and bile salt solutions

圖3 冰淇淋－20 ℃貯存30 d后植物乳桿菌K25在人工模擬胃酸和膽鹽環(huán)境下的存活率Fig.3 Survival rates of cold-/heat-adapted L. plantarum K25 in ice cream during exposure to simulated gastric and bile salt solutions

腸道環(huán)境對菌株活性具有較為顯著的影響[36]，Zárate等[42]研究同時指出，體內(nèi)與體外實驗對益生菌腸道耐受性影響具有較為相似的結果。模擬胃酸環(huán)境脅迫結果（表3和圖3）表明，6 組冰淇淋樣品中的植物乳桿菌K25存活率由大到小分別為C-K25-巧＞H-K25＞H-K25-巧＞K25-巧＞C-K25＞K25，其中C-K25-巧與K25冰淇淋中存活率分別為92.45%和85.19%。模擬膽鹽溶液脅迫結果表明，6 組冰淇淋樣品中的植物乳桿菌K25存活率由大到小分別為C-K25-巧＞H-K25-巧＞C-K25＞K25-巧＞K25＞H-K25，其C-K25-巧和H-K25冰淇淋中活菌數(shù)存活率分別為93.71%和90.48%。所有組別的菌株經(jīng)模擬胃腸道環(huán)境脅迫后，其活菌數(shù)并未有顯著改變（P＞0.05），表明脅迫預處理與巧克力的添加均對菌株存活具有良好的保護作用。Silva等[43]指出B. animalis subsp. lactis BLC1與B. animalis subsp. lactis BB-12在酸性環(huán)境下活菌數(shù)分別下降1.24、3 個對數(shù)級，在膽鹽環(huán)境則分別下降3.82、4 個對數(shù)級。Beley等[44]則指出膽鹽對菌株活性影響主要與損傷細胞膜結構和（或）破壞細胞穩(wěn)定性相關。L. delbrueckii UFV H2b20發(fā)酵冰淇淋，在貯存30 d后，其菌株的模擬腸道環(huán)境耐受性結果與本實驗相似，研究同時指出菌株對膽鹽的耐受程度可能與其生物被膜形成相關[36]。Alamprese等[45]研究表明，市售冰淇淋在貨架期內(nèi)的凍融循環(huán)會對菌株被膜造成破壞，使得菌株在胃液環(huán)境中更容易遭受膽鹽脅迫。Bustos等[46]則進一步指出，在人體胃腸道環(huán)境下，食物基質(zhì)可為菌株提供營養(yǎng)物質(zhì)，菌株數(shù)量也有可能出現(xiàn)上升的現(xiàn)象。值得注意的是王輯等[19]前期實驗表明植物乳桿菌K25具有較為良好的耐酸耐膽鹽特性。

3 結 論

本研究考察不同溫度對植物乳桿菌K25脅迫處理不同時間后對菌株低溫耐受性的影響。結果表明，經(jīng)4 ℃-18 h（C-K25）與55 ℃-0.5 h（H-K25）脅迫預處理后的菌株在－20 ℃貯存30 d后活菌數(shù)分別達到1.10×106、1.35×106CFU/mL，為對照組的12 倍和15 倍。選用該2 株菌株用作冰淇淋的制作，并且添加巧克力作為輔料。結果表明，使用脅迫處理后的菌株發(fā)酵降低冰淇淋產(chǎn)品酸度，顯著增加產(chǎn)品的黏度與硬度（P＜0.05），且低溫處理后的K25發(fā)酵對冰淇淋的膨脹率和融化率產(chǎn)生有益影響。產(chǎn)品于－20 ℃貯存60 d后，C-K25和H-K25活菌數(shù)與對照組相比分別提高1.63、1.69 個對數(shù)級，而 C-K25-巧組活菌數(shù)最高，為7.56（lg（CFU/mL））。冰淇淋于－20 ℃貯存30 d后，對菌株進行模擬胃腸道環(huán)境耐受性分析，結果表明所有組別的菌株均具有較為良好的腸道環(huán)境耐受性。本研究為如何提高植物乳桿菌的低溫耐受性以及冰淇淋產(chǎn)品中植物乳桿菌在貯存期間和人工模擬胃腸道環(huán)境下存活特性提供了研究思路和數(shù)據(jù)支撐，為實際生產(chǎn)中提高冰淇淋中益生菌的存活率提供一種有效的技術方法。