張娜，楊西斌，屈亞威，高健翎，賈馥華，劉海峰

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)武警總醫(yī)院臨床學(xué)院，安徽 合肥 230032；2.中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163；3.武警總醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京100039）

在醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)等相關(guān)基礎(chǔ)研究中，腸道相關(guān)疾病的動(dòng)物模型作為腸道黏膜免疫系統(tǒng)、結(jié)腸炎和癌癥發(fā)展的關(guān)鍵研究工具，其重要性不言而喻。臨床醫(yī)生可通過(guò)內(nèi)鏡系統(tǒng)對(duì)人的腸道病變（如腸道炎癥或腫瘤）進(jìn)行觀察和監(jiān)測(cè)，但由于動(dòng)物體積較小，目前缺乏相關(guān)微型設(shè)備對(duì)動(dòng)物腸道進(jìn)行準(zhǔn)確的在體評(píng)估。潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種局限于大腸黏膜和黏膜下層的慢性復(fù)發(fā)性非特異性腸道炎癥性疾病。目前，對(duì)UC模型的有效評(píng)估依賴于疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）和體外組織病理學(xué)檢測(cè)。DAI評(píng)分指標(biāo)包括小鼠的生活狀態(tài)、體重、大便的性狀和便隱血情況，具有一定的主觀性；病理學(xué)檢測(cè)則需要處死小鼠后分離腸道組織進(jìn)行離體分析。以上方法存在以下缺陷：①無(wú)法對(duì)腸道病變進(jìn)行在體評(píng)估和動(dòng)態(tài)觀察，缺乏可重復(fù)性；②主觀個(gè)體差異及鼠間差異影響結(jié)果準(zhǔn)確性；③離體組織分析需要更多的實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)量，使研究的成本升高。此外，化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)腸癌模型，如偶氮氧甲烷（azoxymethane，AOM）和1，2-二甲肼（1，2-dimethylhydrazine DMH），在結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制及治療方法的研究中得到廣泛應(yīng)用[1]，但模型構(gòu)建周期長(zhǎng)達(dá)30周。采用致癌藥物聯(lián)用（如AOM/DSS，AOM/DMH），雖然縮短了誘導(dǎo)時(shí)間，但至少也需要10周[2]。長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)及小鼠間個(gè)體差異，很難確定每只小鼠腸道內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況。目前，雖然已經(jīng)有微型無(wú)創(chuàng)成像設(shè)備，如正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）[3]，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行在體觀察，但是這些方法成本高且耗時(shí)，而且對(duì)腸道病變不能進(jìn)行清晰和精確的成像。

為了尋找一種安全、經(jīng)濟(jì)和有效的方法，對(duì)小鼠腸道病變進(jìn)行清晰成像和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，本課題組自行組裝小動(dòng)物內(nèi)鏡成像系統(tǒng)，并且對(duì)此設(shè)備的應(yīng)用進(jìn)行了探索研究。

1 材料和方法

1.1 材料

Balb-c nu/nu小鼠（6～8周，體重約18～20 g），購(gòu)于維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodiuln，DSS）（分子量 36 000 ～ 50 000），購(gòu)自華美試劑公司，配置為3%水溶液；麻醉劑（5%氯胺酮+1%甲苯噻嗪）。

1.2 設(shè)備構(gòu)建

依據(jù)電子內(nèi)鏡成像原理，利用光源、信息處理器、視頻顯示系統(tǒng)和內(nèi)鏡4個(gè)部分搭建小動(dòng)物內(nèi)鏡成像系統(tǒng)。系統(tǒng)主要依賴于鏡身前端裝備的成像設(shè)備進(jìn)行圖像采集，經(jīng)圖像傳感器將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電子信號(hào)，后經(jīng)圖像處理器對(duì)信息進(jìn)行處理，再顯示在監(jiān)視器的屏幕上。本系統(tǒng)采用CMOS傳感器，與CCD傳感器相比，具有成本小、集成度高、耗電量較小和硬件開(kāi)發(fā)成本較低等優(yōu)點(diǎn)。光源采用LED冷光源，具有發(fā)光性能穩(wěn)定、體積小、產(chǎn)熱少和節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。利用高清顯示屏進(jìn)行成像，以提高圖像的清晰度。內(nèi)鏡外直徑1.9 cm，鏡身長(zhǎng)度60.0 cm。以上系統(tǒng)均與中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所合作研發(fā)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 UC模型構(gòu)建 取6只小鼠，進(jìn)行編號(hào)后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組自由飲用3% DSS水溶液，對(duì)照組給予蒸餾水飲用，連續(xù)飲用15 d。

1.3.2 內(nèi)鏡下監(jiān)測(cè) 內(nèi)鏡操作前對(duì)成像探頭進(jìn)行水潤(rùn)滑，小鼠進(jìn)行麻醉，麻醉劑使用方法為氯胺酮100 mg/kg+甲苯噻嗪10 mg/kg腹腔注射。待小鼠麻醉后，進(jìn)鏡操作，平均進(jìn)鏡深度約3 cm。根據(jù)UC內(nèi)鏡下嚴(yán)重性評(píng)分（ulcerativecolitis endoscopic index of severity，UCEIS）標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行內(nèi)鏡下評(píng)分，包括：血管模式（血管分布正常1分；血管結(jié)構(gòu)模糊2分；血管閉塞或消失3分）、出血情況（無(wú)出血1分；可見(jiàn)陳舊性出血，用水沖洗后無(wú)血跡2分；可見(jiàn)血跡，用水沖洗后可見(jiàn)滲血3分；活動(dòng)性出血4分）、糜爛和潰瘍（黏膜正常1分；黏膜粗糙、糜爛2分；可見(jiàn)淺表性潰瘍，表面覆白苔3分；可見(jiàn)潰瘍，且深度較深4分）。當(dāng)實(shí)驗(yàn)需要時(shí)，處死小鼠，取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，根據(jù)DIELEMAN評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]從炎癥、隱窩損傷、黏膜再生情況、病變程度和范圍5個(gè)方面對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，并與內(nèi)鏡下評(píng)分進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 設(shè)備示意圖

小動(dòng)物內(nèi)鏡成像設(shè)備實(shí)物圖見(jiàn)圖1A。成像前端可見(jiàn)光源、相機(jī)及輔助操作通道（圖1B），調(diào)節(jié)范圍可達(dá)90°（圖1C）。

2.2 內(nèi)鏡及病理學(xué)評(píng)估

內(nèi)鏡下動(dòng)態(tài)觀察小鼠腸壁黏膜變化，對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)明顯變化，實(shí)驗(yàn)組腸道黏膜動(dòng)態(tài)成像結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第1天，腸道黏膜正常，內(nèi)鏡下可以清晰地看到血管走行和分布（圖2A）；飲用DSS第7天，腸道黏膜血管走行紊亂，黏膜發(fā)紅，粗糙呈顆粒狀，肛門(mén)處病變最明顯（圖2B）；飲用第10天，腸壁黏膜血管走行模糊、紊亂，局部黏膜壞死，多處可見(jiàn)血跡（圖2C）；飲用至第15天，內(nèi)鏡下可見(jiàn)腸壁黏膜脫落，部分腸壁附著有膿性分泌物（圖2D）。分別于第1天、第7天、第10天和第15天，從每組中隨機(jī)各處死一只小鼠，分離遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，并與內(nèi)鏡下評(píng)分進(jìn)行對(duì)比。飲用15 d后兩組組織對(duì)比圖見(jiàn)圖3，肉眼可見(jiàn)對(duì)照組小鼠飲用蒸餾水15 d后，離體腸管組織黏膜呈淡粉色（圖3A），實(shí)驗(yàn)組小鼠飲用DSS 15 d后，腸管組織黏膜明顯充血發(fā)紅（圖3B）。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示：正常結(jié)腸組織黏膜上皮完整，結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞排列整齊，腺體完整（圖3C），實(shí)驗(yàn)組小鼠腸管組織黏膜表層糜爛，有潰瘍形成，腺體多數(shù)不完整，隱窩急性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，呈典型炎癥改變（圖3D）。依據(jù)UCEIS和DIELEMAN評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)腸道病變進(jìn)行內(nèi)鏡和病理學(xué)評(píng)分，結(jié)果顯示：隨著DSS自由飲用時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道病變的內(nèi)鏡與組織病理學(xué)評(píng)分一致呈增高趨勢(shì)。見(jiàn)圖4。

圖1 小動(dòng)物內(nèi)鏡成像設(shè)備實(shí)拍圖Fig.1 Small animal endoscopic imaging equipment actual diagram

圖2 實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道內(nèi)鏡下成像Fig.2 Endoscopic imaging of mice in experimental group

圖3 離體腸組織肉眼觀及病理學(xué)典型圖片F(xiàn)ig.3 Macroscopic view of isolated intestinal tissue and pathological picture

圖4 實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道病變內(nèi)鏡及組織病理學(xué)評(píng)分Fig.4 Endoscopic and histopathological score of mice in experimental group

3 討論

在臨床應(yīng)用中，內(nèi)鏡聯(lián)合病理學(xué)檢查可以對(duì)患者腸道進(jìn)行在體評(píng)估。然而，在動(dòng)物研究中，對(duì)腸道病變進(jìn)行有效評(píng)估的唯一方法為：處死小鼠取病變組織進(jìn)行分析。因此，微型內(nèi)鏡系統(tǒng)的研發(fā)對(duì)動(dòng)物水平的研究具有重要意義。國(guó)外已有相關(guān)研究實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物腸道內(nèi)成像，但是國(guó)內(nèi)仍缺少相關(guān)領(lǐng)域的研究。故本課題組根據(jù)內(nèi)鏡成像原理，自行搭建小動(dòng)物成像平臺(tái)，并對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行了探索。

UC的發(fā)病率在我國(guó)有明顯增加趨勢(shì)[6-8]，而且該病具有癌變傾向。因?yàn)榘l(fā)病機(jī)制不明確，成為研究熱點(diǎn)之一。目前，有多種腸道病變模型構(gòu)建方法，包括化學(xué)藥物誘導(dǎo)型、基因型、細(xì)胞移植型和自發(fā)性動(dòng)物模型[9-11]。本研究采用自由飲用3% DSS的方式構(gòu)建模型，并利用內(nèi)鏡系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行腸道內(nèi)成像，結(jié)果顯示：此內(nèi)鏡系統(tǒng)不僅可以實(shí)現(xiàn)腸道黏膜的清晰成像，而且可以通過(guò)重復(fù)性的操作，對(duì)腸道病變進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。與傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方式（如小鼠狀態(tài)、體重、糞便分析或處死后離體組織學(xué)分析）相比，內(nèi)鏡下成像具有以下優(yōu)勢(shì)：首先，動(dòng)態(tài)觀察是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，可以觀察病變發(fā)展情況；其次，與自身形成對(duì)照，減少了鼠間個(gè)體差異，同時(shí)也有利于選擇最佳個(gè)體進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，提高研究結(jié)果的一致性和可靠性；此外，操作的重復(fù)性可以減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，有效降低研究成本；最重要的是，可依據(jù)成像結(jié)果對(duì)腸道病變進(jìn)行直觀地評(píng)價(jià)。

目前，多數(shù)研究[12-13]使用的均為硬式內(nèi)鏡，存在進(jìn)鏡距離受限及操作難度高等缺陷，本系統(tǒng)采用軟式成像探頭，與現(xiàn)有的硬式內(nèi)鏡相比，能有效調(diào)節(jié)進(jìn)鏡角度、增加進(jìn)鏡深度和降低操作并發(fā)癥的發(fā)生率；此外，此成像探頭直徑小，對(duì)小鼠造成的創(chuàng)傷較小。在未來(lái)的研究中，若與相關(guān)配件設(shè)備配合使用，可實(shí)現(xiàn)腸道黏膜下注射和在體活檢等多種操作。但是此成像系統(tǒng)與其他相關(guān)設(shè)備相比，仍存在成像模式單一的缺點(diǎn)。例如，MITSUNAGA等[14]應(yīng)用的設(shè)備，可結(jié)合熒光探針進(jìn)行熒光成像。SHAO等[15]的研究中，將高分辨顯微內(nèi)鏡（high-resolution fiber-optic microendoscopy，HRME）成像技術(shù)與基于光纖的光聲內(nèi)鏡（fiber-based，real-time C-scan optical-resolution photoacoustic microscopy，F(xiàn)-OR-PAM）相結(jié)合，構(gòu)建新型內(nèi)鏡成像系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)熒光和光聲雙模態(tài)成像，多種成像模式的結(jié)合，具有提高成像效果的作用。因此，本設(shè)備在未來(lái)還有待進(jìn)一步的優(yōu)化。