葛金林，余雯文，曾余豐，金晨慈，戴元榮

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325027；2.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是一種由創(chuàng)傷、輸血、感染等多種因素所導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸功能不全或呼吸衰竭癥狀，有較高的發(fā)病率和病死率[1]。由于ALI確切的發(fā)病機(jī)制不明，因此臨床上尚缺乏有效的針對(duì)ALI的治療方法。目前，有研究證明包括黃芩在內(nèi)的多種中藥在ALI的動(dòng)物模型中，對(duì)肺損傷有治療效果，但其準(zhǔn)確藥理成分及涉及的分子機(jī)制尚不明確。漢黃芩素（wogonin，WOG）作為黃芩的主要藥理成分之一，已被證明可在結(jié)腸炎及皮膚炎癥等動(dòng)物模型中通過(guò)抑制一氧化氮、前列腺素E2等的產(chǎn)生減輕炎癥反應(yīng)[2-4]。但缺乏足夠的研究證明WOG對(duì)ALI的治療效果。因此，本研究利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在小鼠中誘導(dǎo)ALI模型，并予以WOG治療，觀察小鼠肺部損傷改善程度及相關(guān)炎癥指標(biāo)變化，以期為WOG治療ALI的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 C57/BL6（SPF級(jí)，雄性，6～8周齡）小鼠，購(gòu)于上海南方模式生物研究中心，許可證號(hào)：SYXK（滬）2017-0012。LPS和WOG購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；流式抗體anti-CD11b-APC、anti-Gr-1-FITC和anti-F4/80-FITC購(gòu)于英國(guó)BD公司；TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA試劑盒，購(gòu)于深圳達(dá)科為生物科技有限公司；蛋白印跡相關(guān)抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 動(dòng)物分組及ALI模型建立 隨機(jī)將C57/BL6小鼠分為空白對(duì)照組（Control組）、LPS誘導(dǎo)的ALI組（LPS組）、WOG治療組（WOG組），每組10只。各組處理方法如下：Control組和LPS組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液50 μL；WOG組腹腔注射WOG 5 mg/kg。LPS組和WOG組腹腔給藥1 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉 （50 mg/kg）麻醉小鼠，經(jīng)鼻腔滴注LPS（1 μg/kg，每只50 μL），構(gòu)建小鼠ALI模型，Control組麻醉鼻腔滴注相同體積0.9%氯化鈉溶液。

1.3 模型構(gòu)建結(jié)果及藥物治療效果評(píng)估

1.3.1 肺濕重/干重比（W/D）測(cè)定：造模24 h后，每組5只小鼠頸椎脫臼法處死，取全肺組織，用 4 ℃預(yù)冷的PBS洗去肺組織表面的殘血（沖洗2次），在濾紙上吸干水分，稱重，記為肺組織濕重（wet weight，W），然后將其置于80 ℃烘箱中烘烤約48 h 至恒重后稱定干重（dry weight，D），計(jì)算肺W/D。 W/D代表肺含水量，可評(píng)定肺組織水腫的嚴(yán)重程度。

1.3.2 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）收集及細(xì)胞因子檢測(cè)：造模24 h 后，每組5只小鼠頸椎脫臼法處死，剪開頸部皮膚，分離頸部肌肉，暴露氣管，在氣管遠(yuǎn)端剪一小口，插入導(dǎo)管固定。分3次灌洗，每次注射500 μL PBS，停留30 s后抽出，收集BALF，其回收率約為90%。離心BALF，收集上清用于細(xì)胞因子檢測(cè)，收集底層細(xì)胞沉淀用于流式細(xì)胞術(shù)對(duì)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)。用PBS洗滌以上收集的細(xì)胞并進(jìn)行分組，分別加入相應(yīng)的流式抗體冰上孵育1 h，所用的流式抗體包括：anti-CD11b-APC、anti-Gr-1-FITC和anti-F4/80-FITC，隨后用PBS離心洗滌細(xì)胞3次，并用 300 μL PBS重懸細(xì)胞后上機(jī)流式檢測(cè)。最終CD11b+Gr-1+標(biāo)記為中性粒細(xì)胞，CD11b+F4/80+標(biāo)記為巨噬細(xì)胞。將收集的BALF上清液，參照ELISA試劑盒操作說(shuō)明書檢測(cè)BALF中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的濃度。

1.3.3 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察及NF-κB信號(hào)通路蛋白檢測(cè)：“1.3.2”項(xiàng)的5只小鼠打開胸腔，取出肺組織。右肺用4 ℃預(yù)冷的PBS洗去肺組織表面的殘血，然后將其置于多聚甲醛溶液中固定24 h，70%乙醇脫水3次，冰凍切片、HE染色觀察。左肺提取肺組織蛋白，采用BCA法進(jìn)行定量，SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入目標(biāo)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，滴加ECL發(fā)光，顯影，使用Image J進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示，各組間指標(biāo)差異比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WOG對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠肺W/D的影響 LPS氣管灌注造模24 h后，對(duì)其W/D進(jìn)行測(cè)定評(píng)估肺水腫的程度。與Control組比，LPS組W/D值顯著升高，WOG組W/D值顯著低于LPS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 WOG對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織病理學(xué)變化的影響 LPS刺激24 h后，與Control組相比，LPS組小鼠肺部有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞），肺組織間隙可見(jiàn)大量紅細(xì)胞滲出及肺泡壁增厚。與LPS組相比，WOG組小鼠上述病理變化均有明顯改善，見(jiàn)圖2。

圖1 3組肺組織W/D比較

2.3 WOG對(duì)ALI小鼠BALF中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞水平的影響 LPS氣管灌注造模24 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠BALF中炎性細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）數(shù)量。LPS組中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的濃度與Control組比顯著增高（P＜0.01）；與LPS組比，WOG組巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的水平均顯著降低（P＜ 0.01）。見(jiàn)圖3。

2.4 WOG對(duì)ALI小鼠BALF中細(xì)胞因子的影響 LPS氣管灌注造模24 h后，測(cè)定BALF中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的水平。與Control組比，LPS組BALF中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α表 達(dá)水平明顯升高，WOG組BALF中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α表達(dá)水平較LPS組明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

2.5 WOG對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠NF-κB信號(hào)通路的影響 與Control組比，LPS刺激24 h后，LPS組小鼠肺組織IκB（inhibitor of NF-κB）顯著降解，導(dǎo)致磷酸化IκB（p-IκB）大量生成，WOG可明顯地抑制IκB的降解，阻斷NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

3 討論

ALI是由全身炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的綜合征，臨床表現(xiàn)彌漫性肺泡及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肺組織水腫及肺不張等病理特征，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為ARDS。ALI病理改變主要體現(xiàn)在肺泡-毛細(xì)管屏障滲透性增加，炎癥細(xì)胞的細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等炎癥介質(zhì)過(guò)量產(chǎn)生[5-7]。由于ALI發(fā)病機(jī)制不明確且預(yù)后不良，因此是呼吸危重癥醫(yī)學(xué)界研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。本研究通過(guò)構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型，探究傳統(tǒng)中藥黃芪的主要藥理成分WOG治療ALI的潛在作用及機(jī)制，為WOG的臨床運(yùn)用提供理論基礎(chǔ)。

圖2 小鼠肺組織病理切片（HE，×200）

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠BALF中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞水平

與Control組比：aP＜0.05；與LPS組比：bP＜0.05。每組5只

圖5 3組ALI小鼠NF-κB信號(hào)通路檢測(cè)

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，使用LPS進(jìn)行小鼠滴鼻后可在肺組織募集包括中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種炎癥細(xì)胞，而此類炎癥細(xì)胞也可釋放TNF-10、IL-6等炎癥細(xì)胞因子，通過(guò)旁分泌的方式誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞激活引起突發(fā)性呼吸、過(guò)氧化物酶釋放，最終加重肺部損傷[8]。因此，抑制免疫細(xì)胞過(guò)度活化和細(xì)胞因子的分泌是延緩ALI病程的關(guān)鍵。有研究表明，甘草黃酮、姜黃素等中藥能夠通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞、抑制細(xì)胞因子分泌來(lái)治療ALI[9-10]，同時(shí)WOG已經(jīng)在皮膚炎癥、腦損傷等多種炎癥參與的動(dòng)物疾病模型中被證明有治療效 果[3，11]。本研究則發(fā)現(xiàn)WOG對(duì)ALI亦有治療效果，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明預(yù)先腹腔注射5 mg/kg的WOG，可減輕肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）及顯著降低肺組織的W/D；流式細(xì)胞術(shù)及ELISA結(jié)果也顯示W(wǎng)OG治療后BALF中炎性細(xì)胞含量下降，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少。表明WOG可通過(guò)抑制機(jī)體免疫細(xì)胞的過(guò)度活化來(lái)對(duì)ALI起治療效果，且相較于臨床上使用激素治療ALI可能帶來(lái)的不良后遺癥，WOG或有更好的應(yīng)用前景。

參與ALI疾病發(fā)展的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，至今尚未完全明確，但有文獻(xiàn)初步報(bào)道NF-κB信號(hào)途徑在其中發(fā)揮著重要的作用[12-13]。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分LPS可通過(guò)TLR4活化NF-κB信號(hào)通路啟動(dòng)下游如炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10）、黏附分子、集落刺激因子等炎癥信號(hào)的釋放，因此細(xì)菌感染也是導(dǎo)致ALI的重要病因[14-16]。 本研究發(fā)現(xiàn)，WOG可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的活化來(lái)緩解ALI的病情。Western blot結(jié)果表明：LPS刺激后，p-IκB水平升高，顯示NF-κB信號(hào)通路被激活；而在WOG預(yù)先處理的小鼠肺組織中p-IκB水平升高不明顯。因此，WOG處理的小鼠，可以通過(guò)抑制IκB磷酸化的方式抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而影響下游的炎性細(xì)胞因子的釋放，并發(fā)揮相應(yīng)的治療效果。

本研究也存在一定的不足之處，例如未測(cè)定小鼠肺通氣量，細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中NF-κB的p65、p50兩個(gè)亞基的變化水平有待進(jìn)一步分析，以及炎癥相關(guān)的趨化因子的變化水平也有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，WOG可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的活化來(lái)減輕炎癥反應(yīng)，并發(fā)揮對(duì)LPS致小鼠ALI的保護(hù)作用。