李 青 ，羅定強(qiáng) △，尚 飛 ，戴 涌

（1.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065； 2.西電集團(tuán)醫(yī)院，陜西 西安 710077）

菊花七味膠囊由人工牛黃、五靈脂、石膏、紅花、麥冬、苦參、菊花7味中藥組方，具有涼血、清“協(xié)日”的功效，用于治療胃“協(xié)日”，胃酸口苦，食欲不振，血熱頭痛。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)ZZ-8390-1和ZZ-8390-2，前者收載了膽酸、豬去氧膽酸、苦參堿、綠原酸的薄層鑒別，以及膽酸的薄層掃描法含量測定；后者收載了膽酸、苦參薄層鑒別法，以及綠原酸的高效液相色譜（HPLC）法含量測定。文獻(xiàn)［1-3］報(bào)道了菊花七味膠囊中羥基紅花黃色素A、膽紅素、膽酸薄層掃描法的含量測定。菊花七味膠囊已列為2015年度國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高項(xiàng)目，因此本研究中增加了石膏的顯微鑒別法，以及人工牛黃、苦參、菊花對照藥材的薄層鑒別法；建立了人工牛黃中膽酸的蒸發(fā)光高效液相色譜含量測定法；建立了菊花多指標(biāo)［4］310-311的HPLC含量測定法。修訂后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法簡便易行，重復(fù)性較好，可為該制劑的質(zhì)量控制提供檢驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BX41型顯微鏡（奧林巴斯公司）；Waters 2487，Waters e2695系列高效液相色譜儀（美國Waters公司）；檢測器（美國奧泰公司）；BP211D型分析天平（d＝0.01，0.1 mg，賽多利斯公司），BS224S 型分析天平（d＝0.000 1 g，賽多利斯公司 ）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；OVENS 075型臺式干燥器（澳大利亞Axyos公司）。

1.2 試藥

菊花七味膠囊（批號分別為 160301，160302，160303，160304，160305，160306，160307，160308，160309，160310），不含人工牛黃、苦參、菊花的陰性對照樣品，人工牛黃，菊花藥材，均由內(nèi)蒙古惠豐藥業(yè)有限公司提供；人工牛黃對照品（批號為121197-200903），豬去氧膽酸對照品（批號為 111943-201301），膽酸對照品（批號為100078-201415，含量以 98.7% 計(jì)），菊花對照藥材（批號為 121384-201103），綠原酸對照品（批號為110753-201415），紅花對照藥材（批號為 120907-201111），羥基紅花色素 A對照品（批號為 111637-200905），麥冬對照藥材（批號為 121013-201310），苦參對照藥材（批號為121019-201006），苦參堿對照品（批號為110805-200508），氧化苦參堿對照品（批號為110780-201007），綠原酸對照品（批號為 110753-201415，含量以96.2%計(jì)），木犀草苷對照品（批號為110720-201307，含量以 94.0% 計(jì)），3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸對照品（批號為111782-201405，含量以92.0%計(jì)），均購自中國食品藥品檢定研究院。硅膠G板（青島海洋化工廠分廠，批號為20160312）；聚酰胺薄膜（薄層層析用，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；乙腈、甲醇均為色譜純，均購自美國天地公司；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

石膏：取本品粉末，研細(xì)，置顯微鏡下觀察。碎片呈長方形，半透明，具光澤，有時(shí)可見細(xì)密條狀紋理。符合石膏的顯微特征，列入標(biāo)準(zhǔn)正文。詳見圖1。

圖1 石膏顯微特征圖（×400）

2.2 薄層色譜鑒別

人工牛黃：取本品內(nèi)容物0.25 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為供試品溶液。取不含人工牛黃陰性樣品，同法制成人工牛黃陰性對照品溶液。另取人工牛黃對照藥材20 mg，同法制成對照藥材溶液。再取膽酸、豬去氧膽酸對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述5種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇（20∶25∶2∶3）的上層溶液［4］5-6，［5］為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 10% 磷鉬酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與人工牛黃對照藥材溶液和豬去氧膽酸、膽酸對照品溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，斑點(diǎn)分離較好，方法可行。詳見圖2A。

苦參：取本品內(nèi)容物2 g，加甲醇20 mL，加熱回流提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訚獍痹囈? mL，振搖，用三氯甲烷提取2次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液［6］。取不含苦參的陰性樣品，同法制成苦參陰性對照品溶液。另取苦參對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取苦參堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述4種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上［7］，以甲苯 -乙酸乙酯 -丙酮 - 氨水（27 ∶27 ∶9 ∶1）［8］為展開劑，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與苦參堿對照品溶液和苦參對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，斑點(diǎn)分離較好，方法可行。詳見圖2 B。

菊花：取本品內(nèi)容物 1g，加石油醚（60 ～90℃）20mL，超聲處理10 min，濾過，藥渣揮干，加稀鹽酸1 mL、乙酸乙酯50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取不含菊花的陰性樣品，同法制成菊花陰性對照品溶液。另取菊花對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。取綠原酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述4種溶液各2 μL，點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（2∶30∶2∶2 ∶4）的上層溶液［9］為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與菊花對照藥材溶液和綠原酸對照品溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，斑點(diǎn)分離較好，方法可行。詳見圖2 C。

2.3 人工牛黃中膽酸含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：PhenomenexLuna? C18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.3% 乙酸溶液（40 ∶60）；檢測器：蒸發(fā)光檢測器；流速：1.0 mL ／min；柱溫：35 ℃。

2.3.2 溶液制備

取膽酸對照品，精密稱定 12.67 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液（每1 mL含膽酸0.506 8 mg）。取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

圖2 薄層色譜圖

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取不含人工牛黃的陰性樣品0.5 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果陰性對照品溶液對測定無干擾，專屬性好，色譜圖見圖3。

線性關(guān)系考察：取膽酸對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.506 8 g ／L），分別進(jìn)樣 2，5，10，15，20 μL，按擬訂色譜條件測定峰面積，以膽酸進(jìn)樣質(zhì)量的對數(shù)（X）與峰面積的對數(shù)（Y）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得膽酸回歸方程Y＝1.265 2X＋6.057 7，r＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果表明，進(jìn)樣量在 1.013 6 ～10.136 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于 0，2，4，8，12，16，24 h 時(shí)測定，記錄膽酸峰面積。結(jié)果的RSD為1.98%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取膽酸對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，按擬訂色譜條件測定峰面積。結(jié)果的RSD為1.02%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一樣品共6份，依法平行制備供試品溶液，并測定含量。結(jié)果膽酸平均含量為32.9 mg／g，RSD為 2.02% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知膽酸含量的菊花七味膠囊0.25 g，精密稱定，共 6 份，分別加入膽酸對照品（7.43，8.35，8.56，9.68，9.08，7.32 mg，含量以 98.7% 計(jì)），依法制備供試品溶液，測定含量，結(jié)果見表1。

耐用性試驗(yàn)：通過更換色譜柱，樣品測定峰均能基線分離，說明耐用性良好。

2.3.4 樣品含量測定

取10批樣品適量，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定含量。結(jié)果見表2。

2.4 菊花中多指標(biāo)成分含量測定

2.4.1 色譜條件

圖3 人工牛黃中膽酸含量測定高效液相色譜圖

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 10批樣品含量測定結(jié)果（mg／粒）

色譜柱：Agilent Extend-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈為流動相 A，以 0.1%磷酸溶液為流動相 B，按表 3 進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：348 nm；柱溫：35℃。

表3 流動相梯度洗脫

2.4.2 溶液制備

取綠原酸對照品、木犀草苷對照品、3，5-O-二咖啡?；鼘幩釋φ掌愤m量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加70%甲醇制成混合對照品溶液（每1 mL含綠原酸 25 μg，木犀草苷 60 μg，3，5-O- 二咖啡?；鼘幩?15 μg），10 ℃以下保存。取本品內(nèi)容物適量，混勻，取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取不含菊花的陰性對照藥材2.0 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果陰性對照溶液對測定無干擾，專屬性好。色譜圖見圖4。

圖4 菊花中多指標(biāo)成分含量測定高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：按對照品溶液制備方法制備混合對照品溶液（每 1 mL含綠原酸 68.72 μg、木犀草苷73.2 μg、3，5-O- 二咖啡?；鼘幩?43.12 μg），精密吸取上述混合對照品溶液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，備用，精密吸取上述備用溶液1 mL置10，5，3，2 mL 容量瓶中，進(jìn)樣 10 μL，按擬訂色譜條件測定峰面積，以綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬倪M(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，μg／mL）對峰面積（Y）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：綠原酸Y＝16 237X-5 118，r＝0.999 9；木犀草苷Y＝26 947X-9 963.5，r＝0.999 9；3，5-O-二咖啡?；鼘幩醂＝32811.53X-1609.69，r＝1.000 0。結(jié)果表明，進(jìn)樣質(zhì)量濃度綠原酸在3.436～68.720μg／mL范圍內(nèi)，木犀草苷在3.660～73.200μg／mL范圍內(nèi)，3，5-O-二咖啡?；鼘幩嵩?2.156～43.120 μg／mL范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：分別精密吸取同一對照品混合溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣7次，按擬訂色譜條件測定峰面積。結(jié)果綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸峰面積的RSD分別為 0.09%，0.06%，0.08%（n＝7），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液（批號為160301），分別于 0，3，6，9，12，18，24 h 時(shí)測定。結(jié)果綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岱迕娣eRSD分別為 0.61% ，0.78% ，2.29% （n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批供試品（批號為160301），平行制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣、測定。結(jié)果綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬腞SD分別為2.87%，1.99%，2.17%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別往具塞錐形瓶中精密加入綠原酸對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.259 2 g／L，純度為96.2%）1 mL，木犀草苷對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.811 0 g／L，純度為 94.0% ）1 mL，3，5-O-二咖啡?；鼘幩釋φ掌啡芤海ㄙ|(zhì)量濃度為 0.115 9 g／L，純度為 92.0% ）1 mL，揮干溶劑，平行6份，再取已知含量的樣品約1.0g，精密稱定，依法制備供試品溶液，測定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.4.4 樣品含量測定

取10批樣品，依法制備供試品溶液并測定含量。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 定性鑒別試驗(yàn)條件選擇

原標(biāo)準(zhǔn)中人工牛黃的薄層鑒別的展開劑為異辛烷-正丁醚-冰醋酸（8∶5∶5），而正丁醚屬易燃物，易刺激眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚，屬危險(xiǎn)試劑。以正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇（20∶25∶2∶3）為展開劑進(jìn)行人工牛黃的薄層色譜鑒別，展開色譜系統(tǒng)效果好［10］。原標(biāo)準(zhǔn)中苦參薄層鑒別，斑點(diǎn)不清晰，重復(fù)性差，曾調(diào)整供試品的制備方法，更換展開劑，進(jìn)行了耐用性試驗(yàn)，如用不同薄層板（自制與預(yù)制）、不同溫濕度、點(diǎn)樣量和展距等來考察耐用性，結(jié)果斑點(diǎn)分離度、比移值（Rf）等均符合要求，表明方法耐用性較好。菊花的薄層色譜是在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上增加了菊花對照藥材的鑒別，并增加了耐用性試驗(yàn)，結(jié)果耐用性較好。

3.2 人工牛黃中膽酸含量測定色譜條件選擇

人工牛黃是由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?；撬?、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工而成，具有清熱解毒、化痰定驚之功效，為菊花七味膠囊的君藥，需在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中進(jìn)行含量控制，建立了用蒸發(fā)光高效液相色譜法測定人工牛黃中膽酸的含量［11-13］。根據(jù)菊花七味膠囊的處方和制備工藝，分別考察了不同的處理方法，如提取方法（超聲、回流）和提取時(shí)間（15，30，60 min），結(jié)果顯示，超聲30 min的提取更完全。采用不同的色譜柱考察了耐用性。曾考察了10批樣品所用1批生產(chǎn)用人工牛黃藥材，10批樣品轉(zhuǎn)移率分別為90%，97%，91%，89%，93%，93%，92%，90%，90%，88%，基本合理。按照所測藥材90%的轉(zhuǎn)移率計(jì)算出膽酸的含量為17 mg／粒，故去掉10批樣品中低于17 mg／粒的數(shù)據(jù)，其余8批的平均值為 17.4 mg／粒，故暫訂平均總含量 17.4 mg／粒的85%即14.8 mg／粒為限度，即含量限度修訂為本品每粒含人工牛黃以膽酸（C24H40O5）計(jì)，不得少于14.8 mg。

3.3 菊花中多指標(biāo)成分含量測定色譜條件選擇

菊花為菊科植物的干燥頭狀花序，中醫(yī)認(rèn)為菊花性甘，味苦，微寒，歸肺、肝經(jīng)，可散風(fēng)，具平肝明目、清熱解毒之功效。菊花主要用于治療風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花及瘡癰腫毒［14］，是處方量最大的一味藥。此試驗(yàn)中建立了HPLC法測定菊花中多指標(biāo)成分含量的方法［15-16］。根據(jù)菊花在處方中的制備工藝，分別考察了不同的處理方法［17］，如提取方法（超聲、回流），提取溶劑（乙醇、甲醇、50%甲醇、70%甲醇），提取時(shí)間（20，30，40，60 min），結(jié)果顯示，70%甲醇超聲 30 min 的提取更完全，故確定了文中供試品溶液的制備方法。本研究中所用流動相出峰時(shí)間適宜，峰形較好，分離度達(dá)到要求。參考藥典菊花藥材含量的最低限，10批樣品中綠原酸的轉(zhuǎn)移率為19%，木犀草苷的轉(zhuǎn)移率為116%，3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬霓D(zhuǎn)移率為3%，由于綠原酸與3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸屬易分解成分，在生產(chǎn)中容易損失，且轉(zhuǎn)移率很低，故建議本品不測這2種成分，僅測比較穩(wěn)定的木犀草苷。計(jì)算10批樣品中每粒木犀草苷的平均值為38 mg，故暫定木犀草苷平均含量每粒0.38 mg的85%即每粒0.32 mg為限度，即含量限度修訂為本品每粒含菊花以木犀草苷（C21H20O11）計(jì)，不得少于 0.32 mg。