施友文,楊浩然,衛(wèi)兵,張麗麗

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 婦產(chǎn)科,安徽 合肥 230031;2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué),安徽 合肥 230031；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦科,安徽 合肥 230031)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，僅次于乳腺癌和結(jié)直腸癌[1]。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)[2]報(bào)道，宮頸癌死亡人數(shù)位居女性癌癥死亡總數(shù)的第4位。盡管宮頸癌早期檢測(cè)手段多樣，如宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)、陰道鏡活檢病理檢查等[3]，但其術(shù)后復(fù)發(fā)率偏高，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[4]。所以，宮頸癌的早期預(yù)防及診斷水平迫切需要進(jìn)一步提高。

微小核糖核酸(miRNA)是近年來(lái)關(guān)于宮頸癌的研究熱點(diǎn)之一。miRNA是一種內(nèi)源性、非編碼的單鏈小分子RNA，由19～23個(gè)核苷酸組成。成熟的miRNA具有調(diào)控靶基因表達(dá)的作用，能夠抑制靶mRNA的翻譯，最后在轉(zhuǎn)錄后基因水平調(diào)控靶基因的表達(dá)[5- 6]。近年來(lái)研究[7]發(fā)現(xiàn)，與宮頸癌相關(guān)的miRNA標(biāo)記物有多種，包括miRNA- 21、miRNA- 214、miRNA- 155等。MiRNA- 214是較早發(fā)現(xiàn)的具有抑制癌基因活性的miRNA[8- 10]，在宮頸癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中miRNA- 214表達(dá)水平下降，并且miRNA- 214的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、疾病的診斷、預(yù)后等密切相關(guān)。因此，本研究擬采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)miRNA- 214 在宮頸癌患者血漿中的表達(dá)情況，以宮頸癌細(xì)胞株SiHa為細(xì)胞模型，觀察miRNA- 214對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡的影響，了解其可能的分子機(jī)制，為宮頸癌的診斷和治療提供新的策略。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

以2016年1月至2018年1月在中國(guó)科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院確診的50例新發(fā)宮頸癌患者為宮頸癌組，平均年齡為(56.2±14.3)歲，均經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)確診；同時(shí)選取相同年齡段體檢健康者50例(健康對(duì)照組)，按照年齡段與觀察組進(jìn)行匹配。本研究排除接受過(guò)手術(shù)治療、放療、化療等的宮頸癌患者，有嚴(yán)重臟器疾病(如心、肝、肺、腦、腎等器官及血液系統(tǒng)疾病)或其他系統(tǒng)腫瘤病史的患者。本研究符合中國(guó)科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)要求，并且患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 采集兩組全血標(biāo)本各5 ml，用EDTA抗凝管收集，然后離心，分離血漿，收集于EP管中，置冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miRNA- 214的表達(dá) 20 μl PCR反應(yīng)體系為：1 μl特異性miRNA- 214 TaqMan檢測(cè)探針、2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl基因表達(dá)MasterMix、7 μl除RNA酶水以及反轉(zhuǎn)錄得到的總RNA 5 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。對(duì)照組用0.1% DEPC處理。miRNA- 214的上游引物：5′- TGCGGACAGCAGGCACAGAC- 3′，下游引物：5′- GCAGTGCAGGGTCCGAGGT- 3′。最后用AB 17500高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器進(jìn)行PCR檢測(cè)，用相對(duì)表達(dá)值表示miRNA- 214的表達(dá)水平。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 宮頸癌細(xì)胞SiHa由安徽醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。SiHa在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2飽和濕度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，隨機(jī)為宮頸癌對(duì)照組[轉(zhuǎn)染miRNA- 陰性(即miRNA- NC)]和宮頸癌轉(zhuǎn)染miRNA- 214組(轉(zhuǎn)染miRNA- 214模擬物)。轉(zhuǎn)染操作按說(shuō)明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染4 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，重新轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。最后，使用CCK- 8試劑盒(購(gòu)于北京天根生物科技有限公司)，并根據(jù)說(shuō)明書檢測(cè)兩組Siha細(xì)胞增殖的情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miRNA- 214對(duì)SiHa細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響 胰酶消化液消化吸收細(xì)胞，70%乙醇固定，4 ℃過(guò)夜，棄去上清液，以50 μg·ml-1RNAse A溶液重懸，溶液放置1 h，溴化丙啶染液4 ℃下避光孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。最后進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)盒說(shuō)明書進(jìn)行，檢測(cè)盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌組和健康對(duì)照組血漿中的miRNA- 214表達(dá)水平

PCR檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA- 214血漿中的相對(duì)表達(dá)量宮頸癌組為(0.59±0.09) IU·ml-1,低于健康對(duì)照組的(1.08±0.18)IU·ml-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 miRNA- 214對(duì)宮頸癌細(xì)胞SiHa增殖的影響

CCK- 8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與宮頸癌對(duì)照組宮頸癌細(xì)胞SiHa相比，轉(zhuǎn)染miRNA- 214后的宮頸癌細(xì)胞SiHa的生長(zhǎng)速度明顯減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明miRNA- 214對(duì)宮頸癌細(xì)胞SiHa生長(zhǎng)有抑制作用。見圖1。

圖1宮頸癌細(xì)胞SiHa轉(zhuǎn)染miRNA-214組及宮頸癌對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)速度水平

2.3 miRNA- 214對(duì)宮頸癌細(xì)胞SiHa周期和細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，宮頸癌細(xì)胞SiHa轉(zhuǎn)染miRNA- 214組的細(xì)胞在S期細(xì)胞比例明顯降低，凋亡細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)，而在G2/M期的細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。結(jié)果表明宮頸癌細(xì)胞miRNA- 214表達(dá)水平的下降可能會(huì)加速宮頸癌細(xì)胞進(jìn)入G2或M期，反之，miRNA- 214過(guò)表達(dá)則能夠顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。見表1。

表1兩組宮頸癌細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的比較

組 別不同細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)G1SG2/M凋亡率/%SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-214組67.70±3.1424.22±1.076.54±2.375.14±0.37宮頸癌對(duì)照組65.49±2.9927.97±1.429.88±1.734.01±0.42t值12.1410.795.573.92P值0.2310.1860.0270.013

3 討 論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，分子標(biāo)記物在其早期診斷中的作用一直是臨床研究熱點(diǎn)[11]。近年來(lái)大量學(xué)者致力于宮頸癌分子標(biāo)記物的研究，伴隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多宮頸癌相關(guān)的分子標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)[12- 13]。馮倩倩等[14]發(fā)現(xiàn)，miRNA特別是miRNA- 214在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，因此，本研究分析了宮頸癌患者血漿中miRNA- 214表達(dá)水平及miRNA- 214對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程的影響，旨在進(jìn)一步闡明miRNA- 214在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較，宮頸癌患者血漿中miRNA- 214表達(dá)水平明顯下降，這與Wen等[15]的研究結(jié)論一致。Wen等認(rèn)為，在正常情況下機(jī)體內(nèi)各種miRNA表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定；當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)腫瘤病變后，腫瘤細(xì)胞大量地復(fù)制，可能會(huì)影響其它miRNA 的表達(dá)，從而出現(xiàn)某類型miRNA表達(dá)量下降；從另一個(gè)角度來(lái)說(shuō)，如果刺激相應(yīng)類型miRNA的過(guò)表達(dá)，可能會(huì)在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染miRNA- 陰性宮頸癌細(xì)胞SiHa相比，轉(zhuǎn)染miRNA- 214的宮頸癌細(xì)胞SiHa生長(zhǎng)速度明顯減慢，且S期細(xì)胞比例明顯降低，凋亡細(xì)胞比例明顯升高，在G2/M期的細(xì)胞也明顯減少。說(shuō)明miRNA- 214可以抑制宮頸癌細(xì)胞SiHa進(jìn)入S期，并且促進(jìn)其凋亡。Zhang等[16]通過(guò)研究miRNA 對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程影響的分子機(jī)制后認(rèn)為，miRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)核苷酸合成過(guò)程中所必需的酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因此miRNA的過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。而國(guó)外幾項(xiàng)關(guān)于miRNA對(duì)腎癌、膀胱癌及胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn)；miRNA不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[17- 19]。研究者們發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)miRNA的過(guò)表達(dá)，可使得大量腫瘤細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期G2或M期，腫瘤細(xì)胞無(wú)法完成正常的細(xì)胞分裂，并最終走向凋亡。

綜上所述，宮頸癌患者血漿中miRNA- 214表達(dá)水平下調(diào)，可作為宮頸癌早期診斷分子標(biāo)志物。miRNA- 214可以抑制SiHa增殖，并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞SiHa凋亡，miRNA- 214可能在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著抑癌作用。