陳文煒，高星健，張華，陳沁，江濤，高銳，毛厚平

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，福建 福州 350005)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)RCC病例約295 000 例，20%～30%的RCC患者在診斷和腎切除術(shù)時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，5年生存率不足10%[1]。因此，深入研究RCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制具有重要的臨床意義。Ras超家族由Rap家族與Ras共同組成，可參與細(xì)胞增殖、周期、分化等多種生物學(xué)過程，Rap家族共有5個成員，分別為Rap1a、Rap1b、Rap2a、Rap2b和Rap2c，Rap2a在多種類型腫瘤中表達(dá)顯著上調(diào)[2- 3]。在RCC中，Rap2a可通過激活p- Akt途徑參與腎癌發(fā)展惡化[4]。MicroRNA(miR)是一種長約18～22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，可作為原癌基因或抑癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR- 135a與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，其可通過靶向調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因(cellular- myelocytomatosis viral oncogene，c- Myc)表達(dá)來抑制RCC細(xì)胞增殖[6]。然而，miR- 135a對RCC侵襲轉(zhuǎn)移作用的研究報道較少。本研究利用Target Scan軟件預(yù)測出與Rap2a的3′UTR互補(bǔ)結(jié)合的miRNA—miR- 135a，并進(jìn)一步揭示miR- 135a對RCC細(xì)胞遷移侵襲的影響及潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

293T細(xì)胞、正常腎組織細(xì)胞HK- 2及RCC細(xì)胞Ketr- 3、786- O、ACHN購自上海艾睿生物科技有限公司，293T、HK- 2、Ketr- 3、ACHN用含10%FBS(Hyclone,美國)+DMEM(Hyclone，美國)、786- O用RPMI 1640(Hyclone，美國)置于37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

MiR- 135a和陰性對照模擬物購自Gene Pharma(中國上海)公司。用PCR擴(kuò)增Rap2a的編碼序列并克隆至pcDNA3.1質(zhì)粒(Addgene，美國)中，構(gòu)建外源過表達(dá)Rap2a質(zhì)粒。用PCR擴(kuò)增Rap2a的3′UTR片段并克隆至pmirGLO質(zhì)粒(Promega，美國)，構(gòu)建野生型報告質(zhì)粒(Rap2a- WT)，用TakaRa點突變試劑盒將野生型質(zhì)粒上miR- 135a結(jié)合位點進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型報告質(zhì)粒(Rap2a- Mut)。參照Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法實驗

收集細(xì)胞，用含PMSF裂解液提取蛋白，于4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液，用BCA法測蛋白濃度。SDS- PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，切膜并用一抗稀釋液孵育，于4 ℃過夜，二抗稀釋液常溫2 h，曝光顯影?？贵w：Rap2a(1∶1 000,CST，美國)、Akt(1∶1 000,CST,美國)、p- Akt(1∶1 000,CST,美國)。β- actin(1∶1 000,CST,美國)作為內(nèi)參。

1.4 雙熒光素酶報告基因檢測實驗

將pmirGLO- Rap2a- WT、pmirGLO- Rap2a- Mut質(zhì)粒與miR- 135a或陰性對照模擬物共轉(zhuǎn)至293T細(xì)胞，48 h 后用雙熒光素酶活性試劑盒(Promega，美國)檢測熒光素酶活性變化。

1.5 細(xì)胞侵襲遷移檢測

侵襲小室分兩種，一種無預(yù)鋪膠用于細(xì)胞遷移實驗，另一種有預(yù)鋪膠用于細(xì)胞侵襲實驗。將200 μl含5× 104個細(xì)胞的培養(yǎng)液接種至上室中，下室中加入500 μl完全培養(yǎng)液，每組3個復(fù)孔，孵育48 h后用棉簽將上室中殘留物擦掉，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗3次，4%多聚甲醇固定10 min，晾干后結(jié)晶紫染色10 min，雙蒸水洗3次于鏡下觀察，每個小室隨機(jī)選擇3個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Rap2a在RCC細(xì)胞系中高表達(dá)

見圖1。Rap2a在RCC細(xì)胞系Ketr- 3、786- O和ACHN中的表達(dá)明顯高于正常腎組織細(xì)胞HK- 2(P<0.05)，其中Ketr- 3中Rap2a表達(dá)相對最高，故后續(xù)實驗選取Ketr- 3作為研究對象。

圖1Rap2a在腎細(xì)胞HK-2和RCC細(xì)胞786-O、ACHN、Ketr-3中的表達(dá)

2.2 Rap2a是miR- 135a的靶基因

Target Scan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Rap2a是miR- 135a的靶基因，Rap2a的3′UTR中含有與miR- 135a種子區(qū)反向互補(bǔ)的核苷酸序列(圖2A)。將野生型Rap2a- WT和突變型Rap2a- Mut報告質(zhì)粒與miR- 135a或陰性對照模擬物共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，孵育48 h后雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR- 135a可顯著下調(diào)Rap2a- WT的熒光素酶活性，而對Rap2a- Mut的熒光素酶活性無明顯影響(圖2B)，表明Rap2a是miR- 135a的靶基因。

A.miR- 135a與Rap2a的3′UTR結(jié)合位點示意圖；B.報告質(zhì)粒pmirGLO聯(lián)合miRNA模擬物共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞后熒光素酶活性變化；與陰性對照組比較，aP<0.05

圖2miR-135a與Rap2a的3′UTR結(jié)合位點示意圖及對轉(zhuǎn)染Rap2a報告質(zhì)粒的293T細(xì)胞熒光素酶活性的影響

2.3 miR- 135a可抑制Rap2a及其下游信號通路

見圖3、表1。與陰性對照組相比，過表達(dá)miR- 135a后Ketr- 3細(xì)胞中Rap2a及其下游蛋白p- Akt表達(dá)顯著下調(diào)；而miR- 135a和Rap2a共表達(dá)后Ketr- 3細(xì)胞中Rap2a及其下游p- Akt表達(dá)恢復(fù)(P<0.05)。

圖3Ketr-3細(xì)胞中Rap2a、p-Akt、Akt蛋白電泳圖

組 別蛋白相對表達(dá)水平Rap2ap-AktAkt陰性對照組0.81±0.030.96±0.100.51±0.02miR-135a組0.17±0.06a0.38±0.04a0.63±0.08miR-135a+Rap2a組0.79±0.13b0.73±0.09b0.58±0.01

與陰性對照組比較，aP<0.05；與miR- 135a組比較，bP<0.05

2.4 miR- 135a靶向Rap2a對細(xì)胞遷移侵襲影響

Transwell檢測發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，過表達(dá)miR- 135a可顯著抑制Ketr- 3細(xì)胞的遷移侵襲能力，而miR- 135a和Rap2a共表達(dá)后Ketr- 3細(xì)胞遷移侵襲能力恢復(fù)(P<0.05)(圖4A、B)。

A.miR- 135a對細(xì)胞遷移的影響；B.miR- 135a對細(xì)胞侵襲的影響;與陰性對照組比較，aP<0.05；與miR- 135a組比較，bP<0.05

圖4miR-135a對細(xì)胞遷移侵襲能力影響

3 討 論

RCC是泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，放、化療及生物免疫治療均不敏感，手術(shù)是目前主要的治療手段，但有20%～30%的患者在就診之初已發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響預(yù)后[7]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多因素相互作用的復(fù)雜生物學(xué)過程，其中細(xì)胞遷移侵襲是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[8]。因此，針對腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的干預(yù)是腫瘤治療的切入點之一。

Rap2a是Rap GTP結(jié)合蛋白家族的成員之一，屬Ras超家族，其可調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)進(jìn)程，如細(xì)胞黏附、分化和增殖等[9]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，Rap2a與腫瘤的形成及惡化有關(guān)。有研究報道，Rap2a的下游效應(yīng)因子Rap2相互作用蛋白9(Rap2 interacting protein 9,RPIP9)在乳腺癌中的表達(dá)增高，且與乳腺癌的惡性程度密切相關(guān)，其另一下游效應(yīng)因子絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4(mitogen- activated protein kinase kinase kinase kinase4, MAP4K4)在多種腫瘤組織中均高表達(dá)，且與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)[10- 11]。Prabakaran等[12]發(fā)現(xiàn)，Rap2a在從濾泡型甲狀腺癌組織中分離的具有高侵襲能力的癌細(xì)胞中高表達(dá),且與甲狀腺癌浸潤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。上述研究表明，Rap2a在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞遷移侵襲密切相關(guān)。本研究蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，Rap2a在正常腎組織細(xì)胞中低表達(dá)，而在RCC細(xì)胞中高表達(dá)，這與先前文獻(xiàn)研究[4]結(jié)果相一致。然而，其在RCC細(xì)胞中高表達(dá)的機(jī)制仍未完全闡明，推測表觀遺傳的改變可能是導(dǎo)致其高表達(dá)的原因之一。

MicroRNA是表觀遺傳學(xué)中的研究熱點之一，其在調(diào)節(jié)許多蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)能力方面是獨一無二的，一個miRNA能夠靶向調(diào)控許多基因，全面參與調(diào)控多種生物過程[13]。MiR- 135a作為一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的小分子RNA，在多種腫瘤中呈低表達(dá)。Dang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR- 135a在胰腺癌組織中的表達(dá)較癌旁組織顯著下調(diào)，并可通過靶向抑制B細(xì)胞 特異的莫洛尼鼠白血病毒插入位點1基因(B cell- specific Moloney murine leukemia virus integration site 1, Bmi1)的表達(dá)進(jìn)而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Hidaka等[15]在研究腎癌miRNA表達(dá)譜中也發(fā)現(xiàn)miR- 135a顯著低表達(dá)。此外，Yamada等[6]發(fā)現(xiàn)，miR- 135a作為抑癌因子可通過靶向抑制c- Myc表達(dá)來抑制腎癌細(xì)胞增殖。上述研究表明，miR- 135a在多種惡性腫瘤中低表達(dá)，且過表達(dá)miR- 135a可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移侵襲能力。本研究通過TargetScan軟件預(yù)測、雙熒光素酶報告基因檢測和蛋白質(zhì)印跡法實驗證實，Rap2a是miR- 135a的靶基因，并且在RCC細(xì)胞Ketr- 3中，過表達(dá)miR- 135a可通過靶向抑制Rap2a/p- Akt信號進(jìn)而抑制細(xì)胞遷移侵襲能力，miR- 135a在RCC中亦同樣發(fā)揮抑癌基因功能。

綜上所述，本研究證實，miR- 135a作為腫瘤抑制因子，可通過靶向調(diào)控Rap2a抑制RCC細(xì)胞的遷移和侵襲，并下調(diào)Akt信號通路的活化。本研究從表觀遺傳學(xué)角度闡釋Rap2a在RCC中高表達(dá)的可能機(jī)制，為深入了解RCC惡化轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新見解，同時也為RCC的臨床治療提供了新靶點。