張昕，姜悅，張青宇，郭錫熔，池霞，童梅玲

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/南京市婦幼保健院 兒童保健科，江蘇 南京 210004)

sonic hedgehog(shh)是一類分泌性蛋白，其介導(dǎo)的shh信號通路與視網(wǎng)膜發(fā)育密切相關(guān)[1]，它能影響視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的分化，決定感光細(xì)胞的發(fā)育以及視網(wǎng)膜的分層結(jié)構(gòu)等。然而，目前有關(guān)shh及其介導(dǎo)的信號通路調(diào)控視網(wǎng)膜發(fā)育機(jī)制的報(bào)道仍較少。

本研究采用CRISPR/Cas9對斑馬魚的shh基因進(jìn)行編輯[2- 3]，通過鑒定及篩選，初步建立shh基因敲除斑馬魚模型，并比較shh基因突變斑馬魚與野生型斑馬魚形態(tài)及相關(guān)眼發(fā)育的不同，研究shh基因?qū)Π唏R魚生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動物為德國Tubingen品系，購于南京大學(xué)模式動物中心。喂養(yǎng)及產(chǎn)卵方法按照zebrafish Book常規(guī)進(jìn)行，照明14 h、黑暗10 h交替，飼養(yǎng)在循環(huán)水中，水溫保持在(26±2)℃。每天投喂3次豐年蝦片。動物實(shí)驗(yàn)所有操作均得到南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理與使用委員會批準(zhǔn)。

1.2 sgRNA的制備及斑馬魚受精卵顯微注射

分析得到斑馬魚shha蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)功能域，將待敲除目標(biāo)序列設(shè)計(jì)在編碼114aa之后的基因組序列上。設(shè)計(jì)引物gRNA- 1和gRNA- 2。將sgRNA1、sgRNA2和Cas9 mRNA以一定量混合后，顯微注入斑馬魚受精卵，待胚胎發(fā)育至受精后7 h(hours post- fertilization, hpf)時(shí)，隨機(jī)取5枚胚胎進(jìn)行鑒定，確定sgRNA的活性。

1.3 斑馬魚模型的構(gòu)建和篩選

將得到的shha基因敲除的F0代斑馬魚，剪取尾鰭提取DNA，PCR擴(kuò)增驗(yàn)證測序，鑒定出F0代突變基因型。獲得F1，通過剪取尾鰭進(jìn)行基因型鑒定。再以引物對shha F和shha R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用shha F- 2(TAGAAACGTTAAACAACGGC)進(jìn)行測序，通過閱讀測序的色譜圖，確定F1是否為攜帶shha等位基因突變的突變體。將shha突變體F1(♂)和野生型斑馬魚(♀)進(jìn)行交配，收集胚胎(F2)，飼養(yǎng)至2個(gè)月齡，對F2代進(jìn)行基因型鑒定。

1.4 斑馬魚形態(tài)學(xué)觀察及HE染色

收集受精后4 d(days post- fertilization, dpf)斑馬魚幼魚各6條，置于4%多聚甲醛中，進(jìn)行石蠟包埋切片，用二甲苯進(jìn)行脫蠟，無水乙醇進(jìn)行水化，行HE染色，在倒置顯微鏡下觀察野生型及突變體斑馬魚胚胎的發(fā)育變化，并采用捷達(dá)病理圖像分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行拍照。

2 結(jié) 果

2.1 sgRNA識別點(diǎn)及鑒定

根據(jù)蛋白質(zhì)保守功能結(jié)構(gòu)域，將待敲除的目標(biāo)序列(sgRNA識別序列)設(shè)計(jì)在編碼114aa之后(HH- signal)的基因組序列上，設(shè)計(jì)序列為shha F(AATTTGGGAATTGTTTGGAGA)、shha R (GAGAGGGAGTGTGAAGCATTG)、shha- sgRNA1(GAAGAATCACTCCACTACGA【GGG】)、shha- sgRNA2(GACACTGTCTCGCCTAGCTG【TGG】)。結(jié)果表明至少sgRNA2具有活性，且活性大于7.1%。

2.2 F0代基因突變斑馬魚檢測及F1代建立

結(jié)果表明，F(xiàn)0代shha基因敲除的初建者,基因組中突變基因型比例>5%，對109尾F1魚進(jìn)行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)有8尾攜帶突變的等位基因，其中7尾發(fā)生移碼突變，根據(jù)基因分析結(jié)果，最終確定4號突變體為后續(xù)研究對象，如圖1所示。

2.3 斑馬魚shha基因敲除雜交突變體體系的建立

根據(jù)突變體類型，分別設(shè)計(jì)鑒定野生型和突變體的引物，并對其進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示：引物shha- 4bp wt F2(GGACACTGTCTCGCCTAGCT)/shha R(GAGAGGGAGTGTGAAGCATTG)和shha- 4bp mut F1(GGACACTGTCTCGCCTGT)/shha R(GAGAGGGAGTGTGAAGCATTG)可以用于shha突變體的鑒定。F2代斑馬魚17尾中有10尾shha雜合突變。以2號和3號斑馬魚基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以F- shha- 3進(jìn)行Sanger測序，對上述PCR結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。測序結(jié)果表明，建立的PCR法進(jìn)行基因型鑒定是有效的，見圖2A～B。

A～E方框處為sgRNA，除外B，部分序列已發(fā)生indel突變

圖1F1代斑馬魚基因型鑒定

A.19尾斑馬魚擴(kuò)增電泳圖；B.測序驗(yàn)證結(jié)果圖

圖2F2代突變體引物設(shè)計(jì)驗(yàn)證

利用已建立的PCR法對116條F2代斑馬魚進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)共有shha雜合突變后代41尾；進(jìn)一步PCR驗(yàn)證及測序，結(jié)果表明41尾斑馬魚尾攜帶shha移碼突變的雜合突變體，見圖3。

2.4 Shha+/-突變斑馬魚形態(tài)變化及HE染色

與野生型斑馬魚相比，shha+/-突變體胚胎及幼魚多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育受到明顯影響，出現(xiàn)魚卵發(fā)育停滯、脊柱彎曲、心包水腫、眼球發(fā)育較小等異常。受精后96 h，HE染色可見：與同齡野生型斑馬魚相比，突變體視網(wǎng)膜細(xì)胞分層排列，但感光細(xì)胞及視神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育較差，細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞核增大，見圖4。

3 討 論

眼睛是大腦的延伸，是重要的感覺器官。胚胎發(fā)育期間，表面外胚層形成晶狀體和角膜，與前神經(jīng)板形成視網(wǎng)膜上皮層的虹膜和睫狀體[4]。如果在這一時(shí)期出現(xiàn)發(fā)育干擾，就會出現(xiàn)各種眼病，如先天性白內(nèi)障、青光眼和視網(wǎng)膜病，這些疾病發(fā)生均與視網(wǎng)膜感光細(xì)胞及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞受損相關(guān)。還有學(xué)者證實(shí)，實(shí)驗(yàn)性剝奪性近視是由于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變所致。目前國內(nèi)越來越多的兒童出現(xiàn)視力障礙[5]，進(jìn)一步對其機(jī)制進(jìn)行研究很有必要。

A.87尾斑馬魚擴(kuò)增電泳圖;B.shha雜合突變后代41尾;C、D.41尾突變體測序鑒定圖

圖3F2代斑馬魚突變體鑒定

A.對照組；B.突變體

圖4視網(wǎng)膜發(fā)育初步表型鑒定

斑馬魚作為一類具有高度視覺的物種，其通體透明，眼球占頭部體積較大，視網(wǎng)膜與人類具有相似的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，使它成為研究眼球發(fā)育和功能基因控制的理想模型[6- 7]。斑馬魚的視網(wǎng)膜發(fā)育與其他脊椎動物一樣，遵循兩個(gè)原則：從中間到周邊，從內(nèi)到外。多能神經(jīng)前體細(xì)胞在受精后27～28 hpf首先分化成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)，隨后依次分化形成內(nèi)叢狀層、無軸突細(xì)胞層、外叢狀層，于43 hpf出現(xiàn)感光細(xì)胞層，96 hpf時(shí)幼魚孵化完全，其視網(wǎng)膜功能逐步成熟[8- 10]。因此，采用斑馬魚為模式動物可以更好地動態(tài)觀察視網(wǎng)膜的發(fā)育。

脊椎動物的視網(wǎng)膜發(fā)育受許多因素調(diào)控，其中shh及其介導(dǎo)的信號通路與視網(wǎng)膜發(fā)育密切相關(guān)。細(xì)胞分泌shh蛋白后，由靶細(xì)胞膜上的patch和smo兩種受體接收信號，再通過激活下游Gli分子發(fā)揮作用[11]。研究表明：shh參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及感光細(xì)胞的發(fā)育過程[12- 13]；用shh氨基酸片段處理可使體外培養(yǎng)的小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞比例升高[14]；抗shh抗體會影響雞胚視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的生成[15]。由此可見，shh及其介導(dǎo)的信號通路在視網(wǎng)膜發(fā)育中承擔(dān)著重要角色。

研究表明，在Cas9顯微注射的斑馬魚受精卵中，平均約50%能夠發(fā)育成為穩(wěn)定的突變品系并向下傳遞[16]。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以斑馬魚作為模式動物，在shh第2個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)sgRNA靶點(diǎn)，引導(dǎo)Cas9 mRNA進(jìn)行特異性剪切，建立shh移碼突變斑馬魚敲除模型。對F2代斑馬魚進(jìn)行鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，其純合子、雜合子、野生型比例不符合孟德爾定律，推測shh純合子可能致死，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，shha+/-突變體胚胎及幼魚出現(xiàn)魚卵發(fā)育停滯、脊柱彎曲、心包水腫、眼球發(fā)育較小等多種異常，推測shh在各個(gè)系統(tǒng)發(fā)育中均起到重要作用。96 hpf時(shí)，利用HE染色發(fā)現(xiàn)，shh+/- 斑馬魚視網(wǎng)膜分層排列，但感光細(xì)胞及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育差，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞數(shù)減少，胞核變大，據(jù)此可以推斷，shh可能通過影響視網(wǎng)膜感光細(xì)胞及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育來參與相關(guān)眼病的發(fā)生。

在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中，shh的作用不可或缺，但目前其具體的調(diào)控過程及敲除后造成的視網(wǎng)膜損傷機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步探索。本次研究建立了shh突變斑馬魚模型，為后續(xù)研究提供良好的動物模型，為下一步研究致病機(jī)制及相關(guān)信號通路打下基礎(chǔ)。