趙淵，高松，劉連盟，黎起秦，黃世文*

(1.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530003； 2.中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310006；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

水稻惡苗病是由藤倉鐮孢菌(Fusariumfujikuroi)侵染引起的一種真菌病害[1-3]。藥劑種子處理是目前唯一可以依靠的防治該病的有效手段[4-6]。咪鮮胺是防控水稻惡苗病的主要藥劑，在生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛。近年來，由于抗性問題嚴(yán)重，咪鮮胺的藥效降低，用量逐年加大[7-9]。

20世紀(jì)70—80年代，國內(nèi)外接連報(bào)道發(fā)現(xiàn)苯菌靈抗性菌株，此時(shí)距苯并咪唑類殺菌劑大規(guī)模用于水稻惡苗病防治僅僅十幾年時(shí)間[10]。據(jù)日本有關(guān)報(bào)道，20世紀(jì)80年代末到90年代初，對(duì)日本8個(gè)地區(qū)9個(gè)縣采集的病樣進(jìn)行抗性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)惡苗病菌對(duì)苯并咪唑類藥物的抗性已達(dá)很高水平，其中，最低抑菌濃度(MIC)≥100 mg·kg-1的菌株占83.4%[11-12]。在我國，鎮(zhèn)江農(nóng)科所于1990—1992年連續(xù)3 a分別對(duì)全國4省市共16個(gè)縣采集的菌株進(jìn)行苯并咪唑類藥物抗性測(cè)定，結(jié)果表明，MIC≥100 mg·kg-1菌株占所采集菌株的65.9%，抗性菌株已成為這些地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群[13]。目前，我國水稻惡苗病菌對(duì)多菌靈的抗性問題已經(jīng)非常普遍，局部地區(qū)的抗性水平已達(dá)5 000倍以上[14]。

20世紀(jì)90年代，日本幾家大型農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)均分離到了對(duì)咪唑類農(nóng)藥不敏感的菌株，這距咪鮮胺的大面積推廣應(yīng)用尚不足十年[15]。趙志華等[16]研究表明，水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺具有潛在的抗性風(fēng)險(xiǎn)；劉永鋒等[17]研究表明，江蘇省的田間惡苗病菌對(duì)咪鮮胺已有一定的抗性；陳夕軍等[18]分離到了8株抗咪鮮胺的惡苗病菌，且均有很高的抗性水平；鄭睿等[19]研究發(fā)現(xiàn)，江蘇省分離得到的水稻惡苗病菌株對(duì)咪鮮胺全部達(dá)到了中抗和高抗藥性水平，其中高抗咪鮮胺的菌株占比已達(dá)76.62%，說明咪鮮胺高抗藥性菌株已經(jīng)成為江蘇省惡苗病菌的優(yōu)勢(shì)群體。

目前，我國水稻惡苗病咪鮮胺抗性研究以江蘇省為主，浙江省相關(guān)報(bào)道不多。本研究自浙江省杭州市富陽區(qū)采集水稻惡苗病菌株，對(duì)其咪鮮胺敏感性進(jìn)行檢測(cè)，以期初步探明當(dāng)?shù)厮緪好绮【鷮?duì)咪鮮胺的抗性水平，為生產(chǎn)上合理用藥及相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 水稻惡苗病病原菌分離

取水稻惡苗病發(fā)病莖稈，剪成0.5 cm左右的小段，在0.1%升汞溶液中浸泡消毒1 min，75%乙醇溶液消毒30 s，無菌水漂洗3次后，放在添加硫酸鏈霉素的水-瓊脂培養(yǎng)基(WA)上，每個(gè)標(biāo)本放在一個(gè)培養(yǎng)皿里，28 ℃培養(yǎng)至有菌絲產(chǎn)生。挑取菌絲尖端，轉(zhuǎn)移到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，培養(yǎng)直至產(chǎn)孢，經(jīng)單孢分離后，得到水稻惡苗病菌株。

1.2 咪鮮胺對(duì)各菌株的毒力測(cè)定

參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1156.2—2006《農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則 殺菌劑 第2部分：抑制病原真菌菌絲生長試驗(yàn) 平皿法》測(cè)定咪鮮胺對(duì)各菌株的毒力，略有改動(dòng)。在無菌操作條件下，根據(jù)試驗(yàn)處理將預(yù)先融化的滅菌培養(yǎng)基定量(一般為90 mL)加入無菌錐形瓶中，從低濃度到高濃度依次定量吸取藥液，分別加入上述錐形瓶中，充分搖勻。然后等量倒入3個(gè)以上直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，制成相應(yīng)濃度的含藥平板。試驗(yàn)設(shè)不含藥劑的處理作空白對(duì)照，每個(gè)處理不少于3個(gè)重復(fù)。將培養(yǎng)基培養(yǎng)的惡苗病菌(菌齡5 d左右)，在無菌條件下用直徑5 mm的滅菌打孔器自菌落邊緣切取菌餅，用接種器將菌餅接于含藥平板中央，菌絲面朝上，蓋上皿蓋，置28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后調(diào)查病原菌菌絲生長情況。用卡尺測(cè)量菌落直徑(mm)。每個(gè)菌落用十字交叉法垂直測(cè)量直徑各一次，計(jì)算各處理濃度對(duì)供試靶標(biāo)菌的菌絲生長抑制率(%)。

1.3 水稻惡苗病菌的抗藥穩(wěn)定性

在獲得咪鮮胺對(duì)各菌株半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)的基礎(chǔ)上，分別選擇3個(gè)敏感菌株和4個(gè)高抗藥性菌株，接種PDA平板，每2～3 d轉(zhuǎn)接一次，稱為一代。分別測(cè)定咪鮮胺對(duì)轉(zhuǎn)接5、10、20代后敏感菌株和高抗藥性菌株的EC50。

1.4 水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺和其他殺菌劑的交互抗性

在獲得咪鮮胺對(duì)各菌株EC50的基礎(chǔ)上，分別選擇2個(gè)敏感菌株和2個(gè)高抗藥性菌株。分別測(cè)定嘧菌酯、多菌靈和戊唑醇對(duì)以上4個(gè)菌株的EC50，分析咪鮮胺和上述3種殺菌劑的交互抗性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用DPS v9.0.5數(shù)據(jù)分析軟件，根據(jù)各藥劑濃度對(duì)數(shù)值及對(duì)應(yīng)的菌絲生長抑制率作回歸分析，計(jì)算各藥劑的EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻惡苗病菌標(biāo)本的采集和分離

共采集水稻標(biāo)本106份，包括水稻品種60種以上，分離得到單孢菌株85株。

2.2 水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性

通過菌絲生長抑制法測(cè)定85個(gè)水稻惡苗病菌株的EC50(圖1)，值域?yàn)?.012～0.620 mg·kg-1，敏感性相差51倍，但多數(shù)菌株的EC50在0.05～0.10 mg·kg-1。

圖1 各菌株EC50的分布

2.3 水稻惡苗病菌株的抗藥穩(wěn)定性

選取3個(gè)最敏感菌株和4個(gè)抗藥性最強(qiáng)的菌株，分別轉(zhuǎn)代培養(yǎng)5、10、20次，開展抗藥穩(wěn)定性測(cè)試。結(jié)果(表1)表明，敏感菌株的EC50隨著轉(zhuǎn)接代數(shù)升高差異并不明顯，說明敏感菌株在無藥劑選擇壓力的情況下，敏感性保持穩(wěn)定；而高抗藥性菌株對(duì)咪鮮胺的抗性隨著轉(zhuǎn)接代數(shù)提高呈明顯下降趨勢(shì)，其中，CR074轉(zhuǎn)接20代后，其EC50從0.530 mg·kg-1下降到0.370 mg·kg-1，其他3個(gè)高抗藥性菌株轉(zhuǎn)接20代后，EC50仍維持在0.400 mg·kg-1。上述結(jié)果表明，水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺的抗藥性并不穩(wěn)定，在無咪鮮胺選擇壓力的情況下，其抗藥性可隨著菌株的自然繁殖而逐漸降低，但這需要相當(dāng)長的時(shí)間。

表1 水稻惡苗病菌株對(duì)咪鮮胺抗藥性的穩(wěn)定性

2.4 水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺和其他殺菌劑的交互抗性

從表2可以看出，咪鮮胺敏感菌株(CR032和CR102)和高抗藥性菌株(CR014和CR074)對(duì)嘧菌酯的EC50分別為0.71、0.45、0.52、0.24 mg·kg-1，說明水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺和嘧菌酯無交互抗性。咪鮮胺敏感菌株(CR032和CR102)和高抗藥性菌株(CR014和CR074)對(duì)多菌靈的EC50分別為1.71、1.45、1.61、1.42 mg·kg-1，說明水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺和多菌靈亦無交互抗性。咪鮮胺敏感菌株(CR032和CR102)和高抗藥性菌株(CR014和CR074)對(duì)戊唑醇的EC50分別為0.037、0.024、0.080、0.110 mg·kg-1，咪鮮胺高抗藥性菌株對(duì)嘧菌酯的EC50明顯高于咪鮮胺敏感菌株，說明水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺和戊唑醇有交互抗性。

表2 水稻惡苗病菌株對(duì)咪鮮胺及其他 殺菌劑的EC50 mg·kg-1

3 討論

目前，已有多個(gè)關(guān)于水稻惡苗病菌株對(duì)咪鮮胺的敏感性研究，但是研究結(jié)果差異很大，可能與培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等因素有關(guān)。EC50值并不是絕對(duì)的，它受很多因素的影響。本研究通過菌絲生長抑制法測(cè)定了85個(gè)水稻惡苗病菌株的EC50，值域在0.012～0.620 mg·kg-1。相對(duì)其他研究，本研究采樣范圍小，但樣本量大，得到單孢菌株85株。在本研究檢索范圍內(nèi)，還未見對(duì)小范圍的水稻惡苗病抗藥性分化的研究，本研究的完成可為小范圍內(nèi)水稻惡苗病菌及其他病菌抗藥性分化的研究提供參考。

殺菌劑的敏感性在長期停用同一作用類型的殺菌劑后，可以得到一定恢復(fù)，其恢復(fù)時(shí)間和恢復(fù)程度與病原菌對(duì)該類殺菌劑的抗性穩(wěn)定性有關(guān)[20]。水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺的抗藥性并不穩(wěn)定，在無咪鮮胺選擇壓力的情況下，其抗藥性可隨著菌株的自然繁殖而逐漸降低，但這需要相當(dāng)長的時(shí)間。

作物病原菌對(duì)藥劑的交互抗性是指對(duì)一種殺菌劑有抗性的菌株，同時(shí)對(duì)另外幾種殺菌劑有抗性的現(xiàn)象。一般認(rèn)為同一作用機(jī)制的殺菌劑容易產(chǎn)生交互抗性。本研究表明，咪鮮胺和戊唑醇具有交互抗性，而與多菌靈和嘧菌酯無交互抗性。關(guān)于上述交互抗性機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。