周華飛，楊紅福，陳宏州，束兆林，姚克兵，莊義慶

(江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400)

【研究意義】水稻惡苗病又名水稻徒長病，是亞洲、非洲和北美洲一種常見的水稻病害[1]。近些年由于旱育秧技術(shù)和粳稻品種的加速推廣，水稻惡苗病菌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢?！厩叭搜芯窟M展】水稻惡苗病菌可造成水稻產(chǎn)量上10 %～20 %的損失，嚴重時可達50 %，同時導(dǎo)致谷粒變褐等稻米品質(zhì)下降[2]。1998年浙江永嘉惡苗病大面積爆發(fā)，最終統(tǒng)計面積約6500 hm2，損失最高達到產(chǎn)量的15 %。2005年黑龍江惡苗病暴發(fā)成災(zāi)導(dǎo)致農(nóng)戶直接經(jīng)濟損失超過15萬元。近些年來江蘇省受該病的影響也在加大，2012年江蘇省揚州市水稻田部分田塊惡苗病發(fā)病率達到80 %，嚴重威脅水稻產(chǎn)量的安全[3]。在國外以水稻為主的糧食產(chǎn)區(qū)，水稻惡苗病帶來的威脅同樣與日俱增。2002年加利福尼亞統(tǒng)計水稻惡苗病的發(fā)病率達到80 %，造成的水稻產(chǎn)量損失達到30 %[4]。水稻惡苗病在韓國的水稻產(chǎn)區(qū)同樣造成了嚴重的損失[5]?！颈狙芯壳腥朦c】目前水稻惡苗病的防治主要依靠化學(xué)藥劑，常用藥劑為咪鮮胺，主要通過作用于麥角甾醇生物合成途徑來達到防治該病的目的[6]。近幾年咪鮮胺的田間藥效逐年下降，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)水稻惡苗病菌對咪鮮胺已產(chǎn)生一定的抗藥性，江蘇部分地區(qū)的抗藥性已經(jīng)達到很高的水平[7]。【擬解決的關(guān)鍵問題】對于近些年水稻惡苗病菌抗性的產(chǎn)生問題，本研究采集和分離鎮(zhèn)江地區(qū)98株水稻惡苗病菌，進行種屬鑒定，測定其對咪鮮胺的EC50值，檢測靶標位點cyp51A位點的突變情況，旨在為延緩和改良抗性產(chǎn)生提供一定的理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑和菌株

97 %咪鮮胺原藥為江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植物保護研究室提供，使用甲醇配成2.0×103μg·mL-1母液待用。

供試的水稻惡苗病菌株采集于江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所實驗基地及周圍水稻產(chǎn)區(qū)，種植水稻品種主要為武運粳21號、運粳23號和運粳24號，鎮(zhèn)稻18號等等，種植區(qū)常年使用咪鮮胺及其復(fù)配制劑來防治水稻惡苗病[8]。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻惡苗病菌的分離鑒定 將采自于惡苗病發(fā)病田塊的晚期水稻植株接種于固體PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，pH 7.0)[9]上，28 ℃條件下培養(yǎng)直至菌絲出現(xiàn)，進行單孢分離，將獲得的菌株編號保存。將分離的單孢水稻惡苗菌株接種于50 mL液體PDA培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d，過濾獲取菌絲，烘干菌絲。使用真菌DNA提取試劑盒(EasyPure Genomic DNA Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取上述水稻惡苗病菌總DNA，以真菌ITS通用引物(ITS1-5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4-5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[10-13]進行PCR擴增，擴增片段大小為550 bp?？偡磻?yīng)體系(50 μl)：DNA，2 μl；TaqBuffer，5 μl；dNTP，4 μl；Taq酶，1 μl；ITS，各1 μl；ddH2O，36 μl。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35 循環(huán)；72 ℃，10 min；10 ℃ 程序終止。PCR產(chǎn)物片段大小約為550 bp，經(jīng)凝膠電泳檢測確認條帶后，送至上海生工生物工程公司進行測序。測序序列經(jīng)NCBI-BLAST在線比對分析，使用MEGA 4系統(tǒng)發(fā)育進化樹軟件構(gòu)建NJ進化樹，確定上述水稻惡苗病菌的種屬關(guān)系及優(yōu)勢種群。

1.2.2 水稻惡苗病菌對咪鮮胺的EC50測定 以水稻惡苗病菌菌絲的生長速率為依據(jù)的菌絲生長速率法進行測定[14-15]。咪鮮胺原藥濃度梯度設(shè)置為0.001、0.01、0.1、1和10 μg·mL-1，不添加咪鮮胺藥劑的PDA平板作為空白對照CK。在每個平板中央處接種直徑為8 mm的水稻惡苗病菌菌碟，在28 ℃條件下培養(yǎng)直至CK處理平板水稻惡苗病菌菌絲鋪滿整個平板為止。采用十字交叉法測量平板中菌落直徑，根據(jù)下列公式計算咪鮮胺對水稻惡苗病菌的菌絲生長抑制率和EC50值。抑制率={(對照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值)/(對照菌落直徑均值-接種菌餅直徑)}×100 %[16]。采用Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理，分別計算藥劑對供試菌株菌絲生長抑制的EC50值。

根據(jù)陳夕軍等[7]確認的江蘇13個地區(qū)的水稻惡苗病菌對咪鮮胺的敏感性基線EC50為(0.00075±0.00003)μg·mL-1來確定江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌對咪鮮胺抗性倍數(shù)(EC50/敏感性基線)，分為低抗(5～10倍)、中抗(10～100倍)和高抗水平(100倍以上)。

1.2.3 水稻惡苗病菌抗咪鮮胺脫甲基酶cyp51A突變位點檢測 以水稻惡苗病菌對咪鮮胺EC50大小為依據(jù)篩選出抗性和敏感最強的各2株菌株。接種上述4株水稻惡苗病菌于50 mL液體PDA培養(yǎng)基中，28 ℃條件下150 r/min搖培5～7 d，過濾收集菌絲，采用CTAB法提取4株病原菌的全基因組DNA。由NCBI檢索獲取水稻惡苗病菌cyp51A序列F.fujikuroiB14為靶標序列設(shè)計引物cyp51AF(5’-TGTTTCCACTCCTCTACTAC-3’)和cyp51AR(5’-AAGCCTTCCTG CGTTGCC-3’)，PCR擴增大小約為1500 bp的cyp51A片段?？偡磻?yīng)體系(50 μl)：DNA，2 μl；TaqBuffer，5 μl；dNTP，4 μl；高保真Taq酶，1 μl；cyp51AF/R各1 μl；ddH2O，36 μl。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，2 min，35 循環(huán)；72 ℃，10 min；10 ℃，程序終止。PCR擴增片段經(jīng)凝膠電泳確認條帶，切膠回收純化片段送至上海生工生物工程有限公司進行測序。測序序列使用BioEdit軟件比對差異堿基，確認差異位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻惡苗病菌的分離

江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)采集的98株水稻惡苗病菌經(jīng)實驗室單孢分離和純化培養(yǎng)，以其菌絲生長形態(tài)等表型特征，初步判斷全部成功分離上述98株水稻惡苗病菌。

2.2 水稻惡苗病菌的ITS鑒定

分離得到的98株水稻惡苗病菌菌絲DNA經(jīng)ITS序列擴增得到的片段大小約為550 bp，測序堿基序列在NCBI-Blast數(shù)據(jù)庫比對同源度高的序列，使用系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析確認98株全部是水稻惡苗病菌，如表1所示，其中藤倉鐮刀菌[17](Gibberellafujikuroi)90株，層出鐮刀菌[18](Fusariumproliferatum)6株，輪枝鐮刀菌[19](Fusariumverticillioides)1株，新知鐮刀菌[20-21](Fusariumandiyazi)1株。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析可知，江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌優(yōu)勢種群為藤倉鐮刀菌，占比為91.8 %，還出現(xiàn)了近些年才被鑒定的新種新知鐮刀菌1株。

表1 98株水稻惡苗病菌種屬鑒定結(jié)果

2.3 水稻惡苗病菌對咪鮮胺的敏感性分析

通過EC50鑒定結(jié)果可知，江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌對咪鮮胺抗性水平在0.011～0.175 μg·mL-1。依據(jù)抗性倍數(shù)劃分結(jié)果顯示全部是抗性菌株，抗性菌株中高抗菌株占77.6 %，中抗菌株占22.4 %，高抗菌株成為江蘇鎮(zhèn)江惡苗病菌中的優(yōu)勢種群(表2)。

2.4 水稻惡苗病菌抗性位點cyp51A的PCR檢測

cyp51A擴增產(chǎn)物大約為1500 bp，測序后使用BioEdit軟件分析比對之后，比對結(jié)果如圖1所示。對咪鮮胺產(chǎn)生顯著抗性菌株1、2與無抗性產(chǎn)生的敏感菌株3、4在咪鮮胺作用靶標位點cyp51A序列完全一致，說明水稻惡苗病菌對咪鮮胺產(chǎn)生明顯抗性不是由于靶標位點產(chǎn)生的點突變導(dǎo)致，可能是由于其他相關(guān)位點的點突變或轉(zhuǎn)錄過量表達等非核酸突變類型。

3 討 論

近年來，水稻惡苗病逐漸成為水稻生產(chǎn)的主要真菌病害之一，世界上水稻主產(chǎn)區(qū)包括我國的江蘇和安徽等地發(fā)生呈現(xiàn)加重趨勢，造成稻米產(chǎn)量10 %～20 %的損失。隨著稻田旱育秧技術(shù)的推廣，改善了苗床的透氣性，為水稻惡苗病菌繁殖提供有力的條件，加重該病害的發(fā)生。此外，該病害可以還可以依附于水稻種表進行傳代，藥劑浸種處理不徹底將再次加重病害的傳播。目前防治該病害除了依靠品種抗性之外，以多菌靈和咪鮮胺為主的化學(xué)農(nóng)藥成為最主要的手段[23]。水稻惡苗病菌對多菌靈的抗性十分嚴重，藥效十分差勁。近年來，抗咪鮮胺的水稻惡苗病菌逐漸被發(fā)現(xiàn)，咪鮮胺防效同樣呈現(xiàn)下降趨勢。因此，調(diào)查水稻產(chǎn)區(qū)水稻惡苗病菌對咪酰胺的抗性水平，分析抗性產(chǎn)生的原因，為抗性改良和研發(fā)新型防治水稻惡苗病菌藥劑提供理論支持，保證稻米產(chǎn)量及安全。

表2江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌對咪鮮胺抗性調(diào)查統(tǒng)計

Table 2 Survey and statistics on the resistance to prochloraz inFusariummoniliforein Zhenjiang, Jiangsu

抗性等級菌株總數(shù)抗性菌株數(shù)抗性占比(%)高抗987677.6中抗982222.4低抗9800

本研究從江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)分離得到98株水稻惡苗病菌，ITS序列[24-25]系統(tǒng)發(fā)育進化樹確認全部屬于水稻惡苗病菌，主要優(yōu)勢種群為有性態(tài)的藤倉鐮刀菌，還存在少量的層出鐮刀菌與新發(fā)現(xiàn)的新種新知鐮刀菌等，說明江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌種群資源較為豐富，優(yōu)勢致病種群明顯，與鄭睿等[22]報道一致。本研究測定上述98株水稻惡苗病菌對咪鮮胺的抗性水平，EC50結(jié)果顯示江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌抗性比例為100 %，抗性菌株中高抗菌株占比77.6 %，說明水稻惡苗病菌對咪鮮胺已產(chǎn)生大規(guī)?？剐?，且抗性嚴重，咪鮮胺及其復(fù)配藥劑藥效才呈現(xiàn)逐年下降趨勢。鄭睿等[22]報道江蘇常州地區(qū)水稻惡苗病菌對咪鮮胺EC50平均值達到0.253 μg·mL-1，顯著高于江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)的抗性水平，說明江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)咪鮮胺抗性相比其他地區(qū)較低，但長期單一使用咪鮮胺及其復(fù)配藥劑防治水稻惡苗病，定向篩選水稻惡苗病菌抗藥性，依舊會導(dǎo)致抗藥性急劇加重，我們需要研究抗性產(chǎn)生的原因，延緩抗性產(chǎn)生，或為開發(fā)新型藥劑提供依據(jù)。

咪鮮胺類藥劑抑制水稻惡苗病菌等真菌主要途徑是抑制麥角甾醇生物合成路徑中必不可少的羊毛甾醇14-α去甲基酶(P45014DM，由cyp51A負責(zé)合成)[26-28]，該酶主要功能是催化羊毛甾醇的14-α位甲基的剪切，是常用的選擇性抗真菌藥物設(shè)計的靶標位點。趙志華和張錫明等[6,29-30]研究結(jié)果顯示水稻惡苗病菌對咪鮮胺產(chǎn)生抗性機制與麥角甾醇的合成機制有關(guān)，其次是菌體對藥劑的排泄作用導(dǎo)致藥劑流失而產(chǎn)生抗藥性，排泄機制可能與cyp51A的過量表達有關(guān)，與cyp51A基因的核酸序列無關(guān)。本研究分析了對咪鮮胺最敏感和抗性最嚴重的各2株水稻惡苗病菌株的cyp51A位點突變情況，結(jié)果顯示上述4株菌株的cyp51A位點均無明顯的點突變或其他類型突變，證明cyp51A位點不是導(dǎo)致水稻惡苗病菌對咪鮮胺產(chǎn)生抗性的原因。

圖1 2株抗性最高菌株與2株最敏感菌株cyp51A位點序列比對分析Fig.1 Alignment analysis of two highest resistant strains and two most sensitive strains of cyp51A

4 結(jié) 論

江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)水稻惡苗病菌以藤倉鐮刀菌為優(yōu)勢種群，對咪鮮胺已產(chǎn)生較高抗藥性，水稻惡苗病菌抗咪鮮胺機制非cyp51A點突變導(dǎo)致，可能與麥角甾醇合成途徑有關(guān)，也可能是菌體內(nèi)cyp51A的mRNA過表達和直接排泄藥劑來達到對咪鮮胺產(chǎn)生抗性的目的。