許 旭，侯 雪， 韓 梅，邱世婷，毛建霏

(1.中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所，四川 成都 610041；2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都 610066；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(成都)，四川 成都 610066；4.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

【研究意義】植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(PGRs)是一類具有天然植物激素生理活性的人工合成的小分子化合物，能夠有效促進(jìn)、抑制或改變植物生長(zhǎng)發(fā)育[1-3]。5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉(Sodium 5-nitroguaiacolate, 5NG)和對(duì)硝基苯酚鈉(Sodium para-nitrophenolate, SD2)作為復(fù)硝酚鈉的主要成分，是一種高效的PGRs，可通過提高細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞原生質(zhì)流動(dòng)從而加速細(xì)胞生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量并增強(qiáng)抗逆能力[4-5]。此外，5NG和SD2還作為魚、蝦等生長(zhǎng)藥物添加劑，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[6]。雖然5NG和SD2毒性較低，但長(zhǎng)期食用含有5NG和SD2的食品，會(huì)對(duì)人類的身體產(chǎn)生潛在的危害[7]。【前人研究進(jìn)展】目前，國內(nèi)外對(duì)5NG和SD2的研究不夠深入，其殘留安全期和毒理機(jī)制尚不明確，5NG和SD2在食物和環(huán)境中的毒性及殘留成為近幾年來人們?cè)絹碓疥P(guān)心的問題。雖然，許多國家和組織對(duì)可食用植物中常用PGRs的最大殘留限量(MRLs)值有各自的規(guī)定[8-11]，但對(duì)5NG和SD2尚未有明確規(guī)定。關(guān)于硝基酚類化合物的檢測(cè)方法主要有分光光度法、電位法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[12-16]。HPLC基質(zhì)干擾嚴(yán)重，靈敏度低，不能提供分析物的結(jié)構(gòu)信息，容易出現(xiàn)假陽性；GC-MS測(cè)定時(shí)往往需要衍生化，操作繁瑣；而LC-MS/MS以保留時(shí)間、離子對(duì)及離子比率作為定性標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度高、準(zhǔn)確性好。目前，國內(nèi)外已有很多采用LC-MS/MS測(cè)定食品中其他PGRs殘留量的報(bào)道[17-19]，但對(duì)5NG和SD2的研究較少，不能滿足檢測(cè)樣品種類的要求?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文通過優(yōu)化色譜條件及質(zhì)譜參數(shù)，建立了UPLC-MS/MS檢測(cè)4種水果中5NG和SD2的分析方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以期為漿果中5NG和SD2殘留量的快速檢測(cè)提供便捷的手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-30 AD UPLC液相色譜儀(日本Shimadzu公司)和AB SCIEX QTRAP 4500串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB公司)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：對(duì)硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉購自Dr. Ehrenstorfer公司，純度均>97 %。乙腈、甲醇、甲酸、乙酸氨均為色譜純(美國Fisher Scientific公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制 分別準(zhǔn)確稱取對(duì)硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃儲(chǔ)存，再移取儲(chǔ)備液各1 mL，定容至50 mL，配置成2 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制 取不含待測(cè)物的藍(lán)莓、樹莓、草莓及車?yán)遄訕悠?，?.3節(jié)的前處理方法制得空白基質(zhì)溶液，并用其稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配成0.02、0.04、0.20、0.40、0.80、1.60和2.00 mg/kg的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

提取：準(zhǔn)確稱取10.0 g(精確至0.1 g)樣品于50 mL具塞離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋1 min混勻。

分配：加入4.0 g無水硫酸鎂、1.0 g氯化鈉，迅速振搖，渦旋2 min，5000 r/min離心5.0 min，取上清液1∶1(v/v)加水稀釋后，過0.22 μm濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 超高效液相色譜條件

色譜柱：CAPCELL PKA-C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm，2 μm)；流動(dòng)相：A為含5 mmol/L乙酸銨和0.1 %甲酸的水溶液，B為甲醇；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μl；柱溫：35 ℃。梯度洗脫程序?yàn)椋?～2 min，10 %B-50 %B；2～6 min，50 %B-90 %B；6～6.1 min，90 %B-10 %B。

1.5 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描。電噴霧電壓(IS)：-4500 V；離子源溫度：550 ℃;霧化氣(GS1)：60 psi；輔助氣(GS2)：60 psi；氣簾氣(CUR)：40 psi; 定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓(Declusteringpotential: DP)和碰撞能(Collision energy:CE)見表1。

表1 2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)

圖1 MRM下對(duì)硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉的提取離子流色譜圖Fig.1 The extracted ion chromatograms of 5NG and SD2 under the MRM

1.6 基質(zhì)效應(yīng)

通過相對(duì)響應(yīng)值法(基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值)，考察分析物的基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)比值大于1時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，反之，為基質(zhì)抑制效應(yīng)[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

使用直接進(jìn)樣分析目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，優(yōu)化5NG和SD2 2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的質(zhì)譜條件。在負(fù)離子掃描模式下，發(fā)現(xiàn)2種化合物均可產(chǎn)生穩(wěn)定的[M-H]-，選擇[M-H]-作為2種植物調(diào)節(jié)劑的母離子，逐級(jí)優(yōu)化離子對(duì)的碰撞能量和去簇電壓，從而得到響應(yīng)相對(duì)更高的MRM相應(yīng)，優(yōu)化后的參數(shù)設(shè)置見表1。基于已經(jīng)優(yōu)化的質(zhì)譜條件，建立LC-MS/MS分析方法。2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑5NG和SD2的提取離子流色譜圖如圖1所示。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)中的某些共提取物組分對(duì)待測(cè)物的測(cè)定準(zhǔn)確度的影響。LC-MS/MS中基質(zhì)成分雖可以不被監(jiān)測(cè)，但會(huì)隨目標(biāo)物共流出，從而影響化合物的離子化效率，從而抑制或增強(qiáng)化合物信號(hào)[22-23]。這可能是因?yàn)榉菗]發(fā)性的共流出成分在毛細(xì)管出口尖端時(shí)，與分析物競(jìng)爭(zhēng)電離，阻礙或增強(qiáng)了分析物的離子化效果[24-25]。為了提高待測(cè)化合物的測(cè)定準(zhǔn)確度，應(yīng)對(duì)不同基質(zhì)產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而選擇合適方法減小基質(zhì)效應(yīng)的影響。本文采用相對(duì)響應(yīng)值法對(duì)對(duì)硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉在不同基質(zhì)提取液中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)(表2)。4種水果基質(zhì)均對(duì)對(duì)硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉有不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，其中藍(lán)莓、樹莓和車?yán)遄又饕憩F(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而草莓表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，基質(zhì)效應(yīng)不可忽略，應(yīng)采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行定量分析。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

取1.2.2節(jié)的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在儀器工作條件下進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法定量，根據(jù)5NG和SD2的定量MRM峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限，10倍信噪比計(jì)算方法定量限。如表3所示：在0.02～2.00 mg/kg范圍內(nèi)，5NG和SD2線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.9968，方法的檢出限在0.28～0.73 μg/kg，定量限在0.93～2.43 μg/kg。

表2 對(duì)硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉在不同基質(zhì)提取液中的基質(zhì)效應(yīng)

表3不同基質(zhì)中2種植物調(diào)節(jié)劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Table 3 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) for two plant growth regulators in different matrices

化合物Compounds基質(zhì)Matrix線性方程Regression equationrLOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)5NG藍(lán)莓Y=8.98×106X-4.16×1040.99970.732.43樹莓Y=8.94×106X-1.99×1040.99990.632.10草莓Y=7.86×106X-2.85×1040.99980.541.80車?yán)遄覻=1.59×106X-6855.70.99910.712.37SD2藍(lán)莓Y=5.13×106X+7.31×1040.99910.431.43樹莓Y=5.43×106X+9.07×1040.99690.401.33草莓Y=4.93×106X+6.87×1040.99680.321.07車?yán)遄覻=5.53×106X+1.17×1050.99850.280.93

表4 2種植物調(diào)節(jié)劑在不同基質(zhì)中的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.4 方法的精密度和準(zhǔn)確度

取空白基質(zhì)樣品，添加適量相當(dāng)于0.02、0.04、0.40和2.00 mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3節(jié)的條件平行測(cè)定6次。如表4所示：添加回收率在91.75 %～112.67 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.07 %～5.76 %，符合方法學(xué)要求。

3 討 論

本文通過優(yōu)化色譜條件，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定藍(lán)莓、樹莓、草莓和車?yán)遄又?-硝基對(duì)甲氧基苯酚鈉和對(duì)硝基苯酚鈉殘留量的分析方法。樣品用乙腈提取，鹽析除水后直接離心，取上清液進(jìn)行檢測(cè)，無需富集濃縮等特殊凈化步驟。而后對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，4種水果基質(zhì)均對(duì)對(duì)硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉有不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，其中藍(lán)莓、樹莓和車?yán)遄又饕憩F(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而草莓表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。在0.02～2.00 mg/kg范圍內(nèi)，5NG和SD2的質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9968。5-硝基對(duì)甲氧基苯酚鈉和對(duì)硝基苯酚鈉在漿果類水果(藍(lán)莓、樹莓、草莓及車?yán)遄?中的檢出限(LOD)別為0.28～0.73 μg/kg，定量限(LOQ)為0.93～2.43 μg/kg。在4個(gè)添加水平下，樣品添加回收試驗(yàn)的平均回收率為91.75 %～112.67 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.07 %～5.76 %(n=6)。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)建立了藍(lán)莓、樹莓、草莓和車?yán)遄又?-硝基對(duì)甲氧基苯酚鈉和對(duì)硝基苯酚鈉殘留量的快速分析方法。該方法前處理過程簡(jiǎn)單、方法靈敏度高、線性關(guān)系、回收率和精密度均能滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。可作為漿果中5-硝基對(duì)甲氧基苯酚鈉和對(duì)硝基苯酚鈉的快速確證和測(cè)定方法。