黃 興，柴志欣，王 會，姬秋梅，信金偉，鐘金城*

(1.西南民族大學(xué)/青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏 拉薩 850009)

【研究意義】牦牛主要分布于海拔3000 m以上，以青藏高原為中心，及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)，能夠適用高寒缺氧等極端生態(tài)環(huán)境，素有“高原之舟”之稱[1]。能夠充分利用低海拔家畜難以利用的牧草資源，生活自如，繁衍后代。其耐粗、耐勞、善走陡坡險路、雪山沼澤，是高原牧區(qū)主要的運輸工具，為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┎豢苫蛉钡纳a(chǎn)生活資料。由于受分布區(qū)自然環(huán)境條件和經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展水平的限制，加之牧民缺乏科學(xué)的管理，牦牛生產(chǎn)性能不高[2]。因此利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對牦牛生長性狀相關(guān)基因進(jìn)行挖掘并進(jìn)行相關(guān)性分析，也成為牦牛種質(zhì)資源的保護(hù)和經(jīng)濟(jì)性狀選育的主要手段?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生肌決定因子1(Myostatin1，MyoD1)是肌肉調(diào)節(jié)因子(Muscle Regulatory Factors,MRFS)基因家族的一員，對成肌細(xì)胞的生長和分化具有重要的調(diào)控作用[3]。相關(guān)研究表明，牛MyoD1基因定位在第15號染色體上，全長2648 bp，由2個內(nèi)含子和3個外顯子組成[4-5]。MyoD1是調(diào)控骨骼肌生成或再生的一個重要轉(zhuǎn)錄因子，它能夠激活肌肉基因轉(zhuǎn)錄，使非肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〖?xì)胞，調(diào)控肌細(xì)胞的融合，促進(jìn)成肌細(xì)胞分化為肌管，進(jìn)而融合為肌纖維，是調(diào)控脊椎動物胚胎期肌肉發(fā)育過程的主調(diào)控因子[6]，同時也是參與壞損組織修復(fù)。因此，MyoD1基因的改變影響肌肉組織結(jié)構(gòu)的表達(dá)，產(chǎn)生的遺傳改變對嫩度有影響。研究表明MyoD1與肉嫩度數(shù)量性狀顯著相關(guān)[7-8]。近年來，通過對影響牦牛生長發(fā)育等性狀候選基因的研究，篩選出許多影響其經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)鍵位點和分子標(biāo)記[9,12]。目前，對牛、羊、雞、鴨等家畜及家禽MyoD1基因的研究較多，但對牦牛的研究尚存在較大的空缺?！颈狙芯壳腥朦c】鑒于此，本研究通過對西藏不同牦牛類群(品種)MyoD1基因的PCR-RFLP研究，篩選關(guān)鍵SNP位點，并與其體重、體高、體斜長、胸圍、管圍等生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】以期獲得對牦牛重要經(jīng)濟(jì)性狀具有顯著效應(yīng)的遺傳標(biāo)記，為解析牦牛重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳基礎(chǔ)，挖掘鑒定與生長發(fā)育、抗逆、產(chǎn)肉、產(chǎn)乳等性狀相關(guān)的優(yōu)異基因，促進(jìn)牦牛育種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究樣品 選取4個具有代表性的西藏牦牛品種，分別為帕里(PL)26頭、斯布(SB)30頭、申扎(SZ)55頭、類烏齊(LWQ)37頭，共148頭健康成年牦牛。采集耳組織，置于75 %的乙醇，帶回實驗室，-80 ℃保存?zhèn)溆?，同時測定其體重、體高、體斜長、胸圍、管圍等體尺指標(biāo)。

1.1.2 主要試劑與分析軟件 DNA提取試劑盒(TIANGEN)；TaqGreen PCR Master Mix(Thermo)；瓊脂糖(Amresco)、D2000DNA Ladder(BioMIGA)、EDTA、NAOH、甘油，XmaI酶(Thermo)等。

分析軟件有：Primer Premier5.0、Excel2010、SPSS18.0、Popgen1.32、PIC-CALC、DNAMAN5.0、Chromas、Photoscape、BioEidit7.0.5、Watcut在線SNP-RFLP分析軟件等。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取與檢測 利用動物組織基因組DNA提取試劑盒，提取DNA，然后用紫外分光光度計檢測濃度，1.5 %的瓊脂糖檢測其純度，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 構(gòu)建DNA池及SNP查找 分別從每個品種中提取10頭牦牛的DNA，共計40頭，放4度冰箱使其單個自身混勻，1 d之后，測濃度(利用DNA試劑盒洗脫液做空白)。分別測出40個樣的DNA濃度(上層，中層，下層)，平均3次取平均值(需>50 ng/μl)，每個稀釋到50 ng/μl，所有稀釋好的樣品使其混勻，靜止1周達(dá)到充分均勻。設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序并進(jìn)行Chromas軟件處理和DNAMAN比對序列，查找SNP位點。

1.3 引物設(shè)計及PCR產(chǎn)物擴(kuò)增

1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank公布的牛MyoD1基因序列(Accession No:AC_000172)，將內(nèi)含子2以及外顯子3的部分序列應(yīng)用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物(表1)，引物由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 牦牛MyoD1基因的引物序列

1.3.2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增總體系為25 μl：ddH2O 9.5 μl、上下游引物各1μl、DNA模板1μl、DreamTaqGreen PCR Master Mix(2×,1.25 mL) 12.5 μl。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 預(yù)變性2 min，95 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳0.5 h后用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增情況，并保存結(jié)果。

1.4 PCR產(chǎn)物的XmaI酶切

將4 ℃保存的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切體系為20 μl：XmaI酶1.2 μl，10×Buffer 2 μl，ddH2O 8.8 μl，PCR產(chǎn)物8 μl。金屬浴37 ℃，過夜酶切12 h。酶切產(chǎn)物用1.5 %的瓊脂糖凝膠在80 V電壓下電泳50 min后用凝膠成像系統(tǒng)觀察酶切情況，并保存結(jié)果。

1.5 序列分析

PCR產(chǎn)物酶切處理后，顯帶分型，將不同基因型PCR產(chǎn)物純化后送由上海生物工程技術(shù)有限公司測序。利用DNAMAN5.0將測序序列比對，確定突變位點。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel2010、Popgen1.32、PIC-CALC等軟件進(jìn)行西藏4個牦牛品種多態(tài)信息含量(PIC)分析和Hardy-Weinberg平衡檢測，以及基因型、基因頻率、雜合度、有效等位基因數(shù)的計算。運用SPSS18.0軟件采取最小二乘擬合線性模型(least squares fitting linear model)將不同基因型及體尺性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MyoD1-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

對西藏4個牦牛類群不同個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得370 bp的目標(biāo)片段(圖1)。利用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，其特異性好，均無雜帶，與預(yù)期的實驗結(jié)果一致，表明實驗成功，具備后續(xù)實驗的條件。

圖1 MyoD1基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophpresis of MyoD1 gene amplification products

2.2 PCR-RFLP分析

對西藏4個牦牛類群帕里(PL)、斯布(SB)、申扎(SZ)、類烏齊(LWQ)的不同個體進(jìn)行XmaI酶切，通過2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測分型，存在CC、CT、TT 3種基因型,分別為370 bp/50 bp、370 bp/320 bp/50 bp、370 bp(圖2)。

第2、4、9泳道為TT型，3、5、8泳道為CC型，6、7、10泳道為CT型The 2,4,9 lanes are TT genotype: the3,5,8 lanes are CC genotype; the 6,7,10 lanes are CT genotype圖2 西藏牦牛MyoD1片段PCR產(chǎn)物XmaI酶切電泳圖Fig.2 Electrophoresis patterns of digesting PCR products of MyoD1 fragment with XmaI

2.3 SNPs位點篩選與檢測

對不同基因型個體進(jìn)行測序，分析測序峰圖發(fā)現(xiàn)，在MyoD1基因第2內(nèi)含子上并未檢測到突變位點，在外顯子3的部分序列中發(fā)現(xiàn)C-T點突變(C1710T，圖3)。

圖3 MyoD1片段測序結(jié)果Fig.3 The results of sequencing of MyoD-Exon2 fragment

位點Loci品種Breeds個體數(shù)Individuals基因型頻率Genotypes frequencies基因頻率Allele frequenciesCCCTTTCTMyoD-C1710T帕里(PL)260.5000.3850.1150.6920.308斯布(SB)300.3330.5340.1330.6000.400類烏齊(LWQ)550.3460.5090.1450.3950.605申扎(SZ)370.1620.6220.2160.4730.527

表3 4個牦牛類群MyoD1基因1個SNP位點的Hardy-Weinberg平衡的χ2 檢驗

表4 4個牦牛類群MyoD1基因SNP位點的遺傳多態(tài)性指標(biāo)

2.4 突變位點的群體遺傳學(xué)分析

2.4.1 基因型頻率、等位基因頻率、χ2檢驗 由表2,3可知，斯布(SB)、申扎(SZ)、類烏齊(LWQ)3個牦牛類群中雜合型(CT)為優(yōu)勢基因型，基因型頻率分別為0.534、0.509和0.622，而帕里(PL)CC純合型為優(yōu)勢基因，基因頻率達(dá)到0.500。等位基因C在帕里(PL)和斯布(SB)中為優(yōu)勢基因，分別達(dá)到0.692和0.600。等位基因T在申扎(SZ)和類烏齊(LWQ)中為優(yōu)勢基因，分別達(dá)到0.605和0.527。χ2適合性檢驗顯示，χ2分別為0.245、0.371、0.202和2.255，P值均大于0.05，均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

2.4.2 多態(tài)指標(biāo)分析 如表4所示，帕里(PL)、斯布(SB)、申扎(SZ)和類烏齊(LWQ)4個牦牛類群的多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.335、0.365、0.365和0.374，均處于中度多態(tài)(0.25

2.5 MyoD1基因XmaI位點多態(tài)性和生長性狀關(guān)聯(lián)分析

利用SPSS18.0軟件，根據(jù)最小二乘擬合線性模型，對西藏4個牦牛類群MyoD1基因外顯子3上的C1710T突變位點的不同基因型與體尺指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。將4個牦牛類群共計148頭個體整體進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示，CT基因型在身高、體重、體斜長、管圍、胸圍上均大于CC和TT基因型，但差異不顯著(P>0.05)；每個類群單獨分析時，帕里牦牛CC基因型在體重、體斜長、胸圍、管圍上均大于CT和TT基因型，CT基因型在體高上大于CC和TT基因型，但差異不顯著(P>0.05)；斯布牦牛CT基因型在體重、胸圍、管圍上均大于CC和TT型，而體高和體斜長CC型大于CT和TT型，差異不顯著(P>0.05)；申扎牦牛CT型在體重、體高、胸圍和管圍上大于CC和TT型，而體斜長CC型長于CT和TT型，申扎牦牛C1710T突變位點TT和CT基因型與胸圍存在顯著相關(guān)性，CT型的胸圍達(dá)到116.72 cm，TT型胸圍為96.50 cm，相差達(dá)到了20.22 cm,差異顯著(P<0.05；表5)；類烏齊牦牛在生長性狀指標(biāo)上CT型均高于CC和TT型，CT型為優(yōu)勢基因型，但差異不顯著，不存在關(guān)聯(lián)性。

表5 申扎牦牛MyoD1基因Xmal位點對體尺性狀的影響(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：The different scripts (a,b) mean differ significantly (P<0.05).

3 討 論

3.1 候選基因多態(tài)位點的關(guān)聯(lián)性

目前，MyoD1基因多態(tài)性研究在人，小鼠和豬等物種中開展的較早且全面，而對羊和牛等反芻動物的研究相對滯后[13]。1987年Davis[14]利用小鼠的MyoD基因作為探針，克隆并分離了人的MYF3基因，后被證實為MyoD基因。在對豬的研究中，Knoll等[15,18]研究表明豬MyoD基因內(nèi)含子1上存在DdeI-PCR-RFLP位點，且該位點顯著影響眼肌面積、腿臀比例、胴體瘦肉率、皮脂含量和胴體長度，從而間接影響豬肉品質(zhì)，Lee等[19]研究顯示，豬的MyoD基因不同的單核苷酸多態(tài)性影響其基因的表達(dá)水平，并且其在一定程度上對瘦肉率、肌纖維特性及肉質(zhì)性狀存在影響。田璐等[20]在對黃牛的研究中發(fā)現(xiàn)MyoD基因第二內(nèi)含子39和112 bp處存在突變位點，且這2個位點對肉牛的宰前活重、胴體重和凈肉重等有顯著影響。賈偉德[21]在牛MyoD基因家族多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析中發(fā)現(xiàn)該基因第1外顯子166 bp處有一處突變。黃萌等[22]在對肉牛的研究中發(fā)現(xiàn)MyoD基因的第3外顯子1867 bp處存在突變位點，且不同基因型對肉牛的背膘厚和大腿肉厚的具有顯著影響。趙金紅等[23]研究顯示，牛MyoD基因第1外顯子782 bp處發(fā)現(xiàn)一處突變，與肌纖維發(fā)育、肌肉色澤和肉質(zhì)嫩度等方面都密切相關(guān)。已發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點均與基因的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)，而本研究所發(fā)現(xiàn)的突變位點尚未見報道。

本研究通過隨機(jī)挑選1/3左右的樣本建立DNA池，初步確定了西藏牦牛的突變位點，利用在線SNP-RFLP分析軟件篩選出來的XmaI酶對西藏牦牛所有樣本進(jìn)行PCR-RFLP分型，分型后對不同基因型進(jìn)行測序，測序與酶切分型結(jié)果一致。研究顯示，斯布(SB)、申扎(SZ)、類烏齊(LWQ)3個牦牛類群中雜合型(CT)為優(yōu)勢基因，表現(xiàn)出雜合優(yōu)勢，與張潤峰[13]在牛MRF家族基因變異及其與生長性狀的相關(guān)分析中，黃牛群體MyoD基因突變位點基因型雜合型均高于純合型結(jié)果一致；帕里(PL)牦牛純合型(CC)為優(yōu)勢基因，與田璐等[20]在MyoD基因?qū)θ馀ｋ伢w性狀影響的分析中，AA型呈現(xiàn)優(yōu)勢基因情況相似，說明MyoD基因在不同物種中突變位點的優(yōu)勢基因型與關(guān)聯(lián)性狀、分析個體及突變位點本身有關(guān)，除此之外，可能有以下的原因：①所研究的樣本量太小，沒有反應(yīng)出真實的水平，在一定范圍內(nèi)樣本量大小與所觀測到的等位基因的檢出率呈正相關(guān)，同時雜合度較低的位點隨樣本變化波動較大[24]。②該位點的選擇可能存在一些性狀的影響因素或與之連鎖的基因，有證實FoxO1基因和MyoD1基因有著相互調(diào)控的關(guān)系，共同發(fā)揮其生物學(xué)功能[25,28]。

突變位點經(jīng)卡方適合性檢驗得到，χ2分別為0.245、0.371、0.202、2.255，均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。由此可知，在有突變的情況下，經(jīng)自然選擇，加上人為選育的干擾，最終各種因素相互抵消，使得群體仍處于遺傳動態(tài)平衡狀態(tài)。通過對C1710T突變位點多態(tài)性指標(biāo)的分析可知，多態(tài)信息含量(PIC)均處于中度多態(tài)(0.25

3.2 候選基因多態(tài)性與西藏牦牛生長性狀的相關(guān)性討論

利用候選基因多態(tài)性與西藏牦牛生長性狀關(guān)聯(lián)分析，148頭牦牛劃成一個整體進(jìn)行多重比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在身高、體重、體斜長、管圍和胸圍上的均值CT型均大于CC和TT型，且對4個群體單獨分析時，帕里牦牛在體重、體斜長、胸圍和管圍上的均值CC型均大于CT、TT型，斯布牦牛體高和體斜長CC型大于CT和TT型，申扎牦牛在體斜長CC型長于CT和TT型，類烏齊牦牛在5項生長性狀指標(biāo)上CT型均高于CC和TT型，但以上指標(biāo)差異均不顯著，類烏齊牦牛基因型與生長性狀的相關(guān)性與多重比較分析一致。原因可能有：①部分種群的數(shù)量采集的不夠充足，基因型在群體中分布不均。在對不同品種牛的研究上已驗證過[29]。②4個類群分布區(qū)域、海拔高度及地域文化、經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度、人工選育程度均存在差異，使其遺傳特性不同，以致在體型外貌、血液蛋白、染色體特征及DNA分子等多個不同層次上存在差異，研究顯示以上類群均具有豐富的遺傳多樣性[30]。

申扎牦牛MyoD1基因外顯子3上的多態(tài)位點與體尺性狀關(guān)聯(lián)分析，得到TT和CT基因型與胸圍存在著相關(guān)性，差異顯著(P<0.05)，可能和申扎所處地理位置及氣候條件有關(guān)。申扎縣位于西藏西部，平均海拔達(dá)4750 m，高山、丘陵和盆地交錯，為高原亞寒帶季風(fēng)性氣候，主要分布高山灌叢草甸草場，因海拔較高，生態(tài)條件惡劣，植被草場長勢較差，使申扎牦牛整體發(fā)育情況較其它牦牛類群差，前期對申扎牦牛大群體生長指標(biāo)測定顯示，申扎牦牛是目前西藏自治區(qū)現(xiàn)有牦牛類群中個體發(fā)育最小的一個類群。相比較其他地區(qū)，亞東縣帕里鎮(zhèn)，帕里牦牛的主要產(chǎn)區(qū)，平均海拔達(dá)4640 m，冰雪融水量豐富，草場主要分布高寒草甸草場、亞高山草場，牧草充足，是發(fā)展牧業(yè)好地方。而西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣，平均海拔達(dá)4500 m，俗稱“西藏小江南”，這里晝夜溫差較大，但光照充足，氣候類型為高原溫帶半濕潤性氣候，牧草產(chǎn)量豐富，同時類烏齊牦牛膘肥體壯、肉質(zhì)鮮嫩，被列為地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。斯布牦牛分布于西藏自治區(qū)拉薩河流域周圍，平均海拔約4000 m，氣候溫暖而濕潤，牧草長勢良好，牦牛于斯布河谷周圍終年放牧，耐粗飼，繁殖力較高，人為選育的因素較小?？傊暝笈７植紖^(qū)域的氣候條件與帕里，斯布，類烏齊相比更加的惡劣，牧草資源匱乏，總能量存在著夏季富余、冬季不足的現(xiàn)象，生態(tài)系統(tǒng)脆弱，抗干擾能力差。長期以往，牧草長勢好壞直接影響牦牛體格，形成表觀遺傳學(xué)，適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂蚝蜕鷳B(tài)條件。同時申扎縣多農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)相結(jié)合，牦牛選育程度較高，現(xiàn)擁有建成的牦牛育肥實驗基地。人為選育的作用不同[31]，同時生態(tài)氣候因子對牦牛的體型有著直接的影響[32]，這兩個因素共同影響其遺傳選擇[33]。

Verner等[34]報道豬的MyoD基因多態(tài)性與大理石花紋性狀具有極顯著相關(guān)性；田璐等[20]在3個不同品種的黃牛(魯西牛、晉南牛、秦川牛)和4個雜交牛品種中，對MyoD基因第二內(nèi)含子SSCP多態(tài)位點進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點與胴體性狀(如胴體重、凈肉重、高檔肉重、眼肌面積)差異顯著；Bhuiyan等[35]研究結(jié)果表明MyoD基因與生長和胴體性狀具有極顯著相關(guān)性；在2012年，褚敏等[36-37]在對180頭成年甘南牦牛和296頭成年大通牦牛的MyoD1基因研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點與體尺性狀差異顯著。通過以上研究顯示，MyoD基因可作為影響不同物種生長發(fā)育及肉質(zhì)性狀的候選基因。通過對西藏牦牛的MyoD1基因的研究，C1710T多態(tài)位點與申扎牦牛胸圍存在相關(guān)性，為后續(xù)研究提供了依據(jù)，可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，廣泛開展對不同品種的研究，增加調(diào)控區(qū)段的多態(tài)性位點的研究，進(jìn)一步了解基因的遺傳效應(yīng)，為選育自己有特色的地方牦牛品種提供貢獻(xiàn)以及帶來經(jīng)濟(jì)效益，為少數(shù)民族地區(qū)帶來福祉。

4 結(jié) 論

綜合西藏牦牛MyoD1基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的基礎(chǔ)資料，MyoD1基因內(nèi)含子2上未發(fā)現(xiàn)突變位點，外顯子3上發(fā)現(xiàn)一個SNP(C1710T)，為XmaI酶切位點。基因型與生長性狀關(guān)聯(lián)分析可知，申扎牦牛CT型和TT型基因型個體存在顯著差異(P<0.05)，3種基因型與胸圍顯著相關(guān)，其他牦牛類群差異均不顯著。4個群體MyoD1外顯子3上的C1710T突變位點多態(tài)性高，遺傳變異大。申扎牦牛C1710T多態(tài)位點可能是影響體尺性狀的重要功能基因座，是一個作為改良生長性狀的遺傳位點，具有很好的研究價值。