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        不同生長(zhǎng)速率肉雞腸道真菌結(jié)構(gòu)分析

        2019-01-28 05:49:40溫雪婷朱江群朱建芬肖英平李娜楊華
        浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年1期
        關(guān)鍵詞:菌門肉雞群落

        溫雪婷,朱江群,朱建芬,肖英平,李娜,楊華*

        (1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,浙江 杭州 311300; 2.余杭區(qū)余杭街道農(nóng)業(yè)公共服務(wù)中心,浙江 杭州 311100; 3.余杭區(qū)塘棲鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)公共服務(wù)中心,浙江 杭州 311106; 4.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所,浙江 杭州 310021)

        動(dòng)物腸道內(nèi)寄居著大量共生微生物,包括真菌、細(xì)菌、古菌及病毒,其中真菌是腸道菌群的重要組成部分,結(jié)構(gòu)受日齡、性別、飼糧、品種、地域、藥物、疾病等因素的影響[1]。與其他腸道菌相比,腸道真菌的豐度和多樣性較低,存在明顯的個(gè)體差異[2-3],且其組成并不穩(wěn)定,不同時(shí)間真菌組成相似性低[4-6]。由于真菌在腸道中的豐度低、含量少,因此通用引物擴(kuò)增真菌DNA時(shí)會(huì)出現(xiàn)陰性結(jié)果,在某種程度上限制了腸道真菌的研究。

        在正常情況下,腸道內(nèi)細(xì)菌、病毒和真菌菌群之間存在穩(wěn)定的對(duì)抗、協(xié)同或共生關(guān)系[7-8]。腸道中真菌多樣性分布可能是飲食和環(huán)境因素的體現(xiàn),同時(shí)也是真菌菌群同宿主腸道免疫系統(tǒng),以及土著微生物與外源真菌之間相互作用的體現(xiàn)。真菌可通過(guò)與細(xì)菌的相互作用從而改變腸道生物屏障[9-10],引起腸道通透性增加,導(dǎo)致腸腔內(nèi)真菌易位到腸腔以外部位并引起侵襲性感染。消化道真菌感染可由腸道正常真菌菌群或是外來(lái)的致病菌引發(fā),真菌性食管炎及胃炎的主要致病菌為白色念珠菌,毛霉菌屬、念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬等可導(dǎo)致腸道的真菌性炎癥[1,11]。不同腸段優(yōu)勢(shì)真菌與真菌結(jié)構(gòu)不同[12],研究還發(fā)現(xiàn)人類肥胖組與非肥胖組的腸道真菌多樣性存在差異,肥胖組的真菌多樣性較非肥胖組降低,毛霉菌在非肥胖組中檢測(cè)率最高,毛霉屬的相對(duì)豐度與體質(zhì)量降低程度呈正相關(guān)[13-14]。

        本研究旨在利用高通量測(cè)序技術(shù)比較不同生長(zhǎng)速率肉雞盲腸真菌組成差異,探索肉雞腸道真菌結(jié)構(gòu)與雞生長(zhǎng)速率的關(guān)系,為正確定義“肉雞健康腸道真菌菌群”提供更多理論數(shù)據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與采樣

        選擇10 000只羅斯308肉雞常規(guī)飼養(yǎng)。1~2日齡時(shí),提供24 h的光周期,飼養(yǎng)溫度32~34 ℃;隨后提供16 h的光周期,溫度每周減少2~3 ℃,至20 ℃。所有肉雞飼喂相同配合飼料,隨意采食[15]。38日齡時(shí),從中隨機(jī)挑選600只公雞,選取其中體質(zhì)量最高的8只作雞H組,(3 146.25±92.57)g,體質(zhì)量中等的8只雞作M組,(2 212.5±14.88)g和體質(zhì)量最低的8只雞作L組,(1 127.5±93.16)g。頸椎脫位處死,屠宰后立刻取其盲腸內(nèi)容物,標(biāo)記為H1~H8、M1~M8和L1~L8,液氮冷凍,-80 ℃儲(chǔ)存待測(cè)。

        1.2 DNA提取、擴(kuò)增與高通量測(cè)序

        使用DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)提取樣本DNA,并存儲(chǔ)于-80 ℃。以提取的DNA為模板,使用ITS2引物ITS3-2024F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4-2409R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行ITS測(cè)序分析,由llumina HiSeq 2500平臺(tái)測(cè)序[4]。

        1.3 序列分析與系統(tǒng)分類

        采用QIIME軟件(V1.7.0)進(jìn)行序列的質(zhì)量控制及過(guò)濾,剔除低質(zhì)量的DNA序列。在QIIME中調(diào)用uCLUST對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按相似度97%進(jìn)行聚類,定義為操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。利用聚類 OTUs 構(gòu)造稀釋曲線,并用 QIIME計(jì)算各樣品的α多樣性指數(shù)(ChaoⅠ、ACE、Simpson、 Shannon和覆蓋度指數(shù)),并用R軟件包(Version 2.15.3)顯示。使用Sliva和RPD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有OTU的代表性序列進(jìn)行物種匹配,在門和屬的水平上對(duì)樣品的真菌組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì),得到菌群分布結(jié)果,并繪制柱狀圖。進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)和聚類分析,對(duì)樣本間物種多樣性差異進(jìn)行分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 α多樣性

        通過(guò)Chao1豐富度估計(jì)量、ACE指數(shù)計(jì)算菌群豐度,香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon diversity index)、辛普森多樣性指數(shù)(Simpson diversity index)計(jì)算菌群多樣性,覆蓋率指數(shù)(Coverage index)刻畫序列深度(表1)。研究發(fā)現(xiàn),最低體質(zhì)量組雞盲腸內(nèi)容物真菌豐度最高(Chao1:451.352,ACE:438.521),最高體質(zhì)量組雞盲腸內(nèi)容物菌群多樣性最高(Shannon指數(shù):4.413,Simpson指數(shù):0.838)。所測(cè)樣品覆蓋率指數(shù)均超過(guò)99.8%,表明本次測(cè)序結(jié)果能夠代表樣本的真實(shí)情況。

        表1 各供試組的α多樣性指數(shù)

        2.2 腸道真菌菌群結(jié)構(gòu)分布

        稀釋曲線用于評(píng)價(jià)測(cè)序量是否足以覆蓋所有類群,并間接反映樣品中物種的豐富程度。取樣943 0 reads,隨著取樣reads的增加,新發(fā)現(xiàn)的OTUs減少,取樣565 80 reads時(shí),稀疏曲線趨于飽和(圖1)。這表明,樣本庫(kù)的大小足以估計(jì)相似閾值97%的菌種豐度和真菌群落多樣性。

        圖1 腸道真菌菌群結(jié)構(gòu)分布的稀疏曲線

        研究發(fā)現(xiàn),所有序列可分為5個(gè)門:球囊菌門(Glomeromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)(圖2)。豐度最高的10個(gè)屬分別為念球菌屬(Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus)、曲霉屬(Aspergillus)、哈薩克斯坦酵母(Kazachstania)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、赤霉菌屬(Gibberella)、微囊菌屬(Microascus)、Phialemoniopsis、鏈格孢屬(Alternaria)和木霉屬(Trichoderma)。在門水平上,子囊菌門為優(yōu)勢(shì)菌門;在屬水平上,不同組腸道真菌沒有明顯的規(guī)律,樣本間個(gè)體差異大。

        2.3 菌群聚類分析和主坐標(biāo)分析

        為了對(duì)各組腸道真菌群落進(jìn)行比較,進(jìn)行聚類分析與主坐標(biāo)分析(PCoA)。聚類分析根據(jù)OUT數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后,選取數(shù)目最多的35個(gè)菌屬,基于R熱點(diǎn)圖進(jìn)行作圖,熱圖中的每1個(gè)色塊代表1個(gè)樣品在1個(gè)屬水平上的豐度。不同分組橫向排列,屬縱向排列,對(duì)樣品進(jìn)行聚類,從聚類中可以了解樣品之間的相似性以及屬水平上的群落構(gòu)成相似性(圖3)。研究發(fā)現(xiàn),最低體質(zhì)量組腸道真菌豐度較高的有德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、小囊屬(Microascus)、毛霉菌(Mucor)等。

        圖2 不同樣品中真菌群落組成

        圖3 真菌結(jié)構(gòu)的熱點(diǎn)

        主坐標(biāo)分析PCoA沒有改變樣品點(diǎn)之間的相互位置關(guān)系,只是改變了坐標(biāo)系統(tǒng)。通過(guò)PCoA可以觀察個(gè)體或群體間的差異。每1個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)樣本,相同顏色的點(diǎn)來(lái)自同1個(gè)分組,兩點(diǎn)之間距離越近表明兩者的群落構(gòu)成差異越小(圖4)。研究發(fā)現(xiàn),最低體質(zhì)量組與最高體質(zhì)量組肉雞腸道真菌群落構(gòu)成差異較大,最低體質(zhì)量組與中等體質(zhì)量組、中等體質(zhì)量組與最高體質(zhì)量組肉雞腸道真菌群落構(gòu)成差異較小。最低體質(zhì)量組與中等體質(zhì)量組組內(nèi)個(gè)體差異較最高體質(zhì)量組小。

        圖4 菌群的主坐標(biāo)分析

        3 小結(jié)

        肉雞腸道真菌序列聚集成2 759個(gè)OTUs,分為5個(gè)菌門:球囊菌門(Glomeromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)。豐度最高的10個(gè)屬分別為念球菌屬(Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus)、曲霉屬(Aspergillus)、哈薩克斯坦酵母(Kazachstania)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、赤霉菌屬(Gibberella)、微囊菌屬(Microascus)、Phialemoniopsis、鏈格孢屬(Alternaria)和木霉屬(Trichoderma)。α多樣性指數(shù)表明,最低體質(zhì)量組真菌的豐度最高,其次為中等體質(zhì)量組和最高體質(zhì)量組;最高體質(zhì)量組的菌群多樣性最高,其次為中等體質(zhì)量組和最低體質(zhì)量組。肉雞腸道優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門,屬水平上腸道真菌有較大的個(gè)體差異。最低體質(zhì)量組與最高體質(zhì)量組肉雞腸道真菌群落構(gòu)成差異較大。已知曲霉菌、毛霉菌可導(dǎo)致腸道真菌性炎癥,毛霉屬的相對(duì)豐度與體質(zhì)量降低程度呈正相關(guān)[13],通過(guò)熱點(diǎn)圖可知,最低體質(zhì)量肉雞腸道組曲霉菌屬(Aspergillus)、毛霉菌(Mucor)豐度較高。

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