魏琳玲 丁 科

高脂血癥是指血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）過(guò)高而血清高密度脂蛋白（HDL）過(guò)低的脂代謝異常疾病。作為動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素之一，高脂血癥會(huì)誘發(fā)一系列心腦血管疾病。近年來(lái)，越來(lái)越多的中藥被用于治療高脂血癥的研究[1]。中藥藏紅花，又稱西紅花，是鳶尾科番紅花Crocus sativus L.的干燥柱頭。中醫(yī)認(rèn)為藏紅花性甘，平，歸心、肝經(jīng)，具有活血化瘀，涼血解毒，解郁安神的功效。常用于經(jīng)閉癥瘕，產(chǎn)后瘀阻，溫毒發(fā)斑，優(yōu)郁痞閼，驚悸發(fā)狂[2]。藏紅花主要成分為番紅花苦苷、番紅花苷 I～I(xiàn)I、藏紅花醛、α-番紅花酸，α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素等[3-5]。金黃地鼠具有血量充足、膽固醇耐受好、模型穩(wěn)定、成本較低等優(yōu)勢(shì)，目前被普遍用于飲食性誘導(dǎo)的肥胖及高脂血癥的研究[6-9]。本研究采用金黃地鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，建立飲食性高脂血癥金黃地鼠模型，給予不同劑量藏紅花水提物，探討藏紅花水提物對(duì)高脂血癥模型金黃地鼠肝臟保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性金黃地鼠60只，5周齡，體質(zhì)量（80±5）g，購(gòu)于北京維通利華生物科技有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0011；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號(hào)SYXK（浙）2013-0184，初始體質(zhì)量差異均不顯著。實(shí)驗(yàn)用基礎(chǔ)飼料由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，高脂飼料購(gòu)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，配方為基礎(chǔ)飼料68%，蔗糖10%，豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇2%。

1.2 藥物與試劑 本實(shí)驗(yàn)所用藏紅花水提液，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥體外代謝實(shí)驗(yàn)室提供；TG試劑盒（批號(hào)4818UN18）、TC試劑盒（批號(hào)12061UN11）購(gòu)自雅培制藥有限公司；LDL-C試劑盒（批號(hào)9260099）、HDL-C 試劑盒（批號(hào) 92469095）、ALT 試劑盒（批號(hào)020334）、AST試劑盒（批號(hào) 010201）購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司；辛伐他?。ㄒ?guī)格：20mg×7片、批號(hào)H19990366）購(gòu)自默沙東制藥有限公司；PPAR-γ抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購(gòu)自上海碧云天。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，定量PCR試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PPAR-γ：上游引物：5’-CTGATGCTTTAACCCCACAGACTCGG-3；下游引物：5’-CCCTTTACCACAGTTGATTTCTCCAG-3；GAPDH：上游引物：5’-CATCACCATCTTCCAGGAGC G-3；下游引物：5’-GAGGGGCCATCCACAGTCTTC-3。

1.3 儀 器 全自動(dòng)血脂生化分析儀（德國(guó)羅氏診斷有限公司）；Tecan酶標(biāo)儀（瑞士）；熒光顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（日本）；移液槍（德國(guó) Eppendorf）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore公司，美國(guó)），Minispin離心機(jī)（eppendorf公司，德國(guó)），多功能酶標(biāo)儀（TECAN公司，奧地利）；Chemi Scope 6300化學(xué)發(fā)光成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 模型制備及分組給藥 60只金黃地鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察1周，根據(jù)初始體質(zhì)量，隨機(jī)取8只金黃地鼠作為正常組，給予普通飼料，其余52只給予高脂飼料進(jìn)行造模，造模時(shí)間4周，造模結(jié)束后對(duì)所有金黃地鼠進(jìn)行血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平檢測(cè)，當(dāng)造模組金黃地鼠血清TC、TG水平較對(duì)照組有極顯著性差異（P＜0.01）時(shí)，說(shuō)明造模成功，同時(shí)剔除不符合造模標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物。

剔除后將造模成功的40只金黃地鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成五組，即模型組、藏紅花水提液低、中、高（劑量分別為 5，10，20g·kg-1·d-1）劑量組及陽(yáng)性藥辛伐他?。?5mg·kg-1·d-1）組，每組 8 只。各給藥組分別灌胃給予不同濃度藥物，給藥體積為2mL/100g，1d1次，連續(xù)給藥4周，正常組和模型組灌胃給予等體積的生理鹽水。正常組飼以普通飼料，其余組飼以高脂飼料，自由飲水進(jìn)食。

2.2 指標(biāo)檢測(cè) 給藥后每周測(cè)量2次體質(zhì)量，第4周末統(tǒng)計(jì)攝食量，心臟取血，全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清TC，TG，高密度脂蛋白（HDL-C），低密度脂蛋白（LDL-C），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT），天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平，并根據(jù)結(jié)果計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（TG/HDL-C），冠狀動(dòng)脈指數(shù)（LDL-C/HDL-C）。

2.3 肝臟形態(tài)及病理學(xué)觀察 處理各金黃地鼠，稱取體質(zhì)量，取肝組織、脂肪組織，稱量肝組織質(zhì)量。采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肝組織脂肪變化及炎癥程度，油紅O染色觀察金黃地鼠肝臟組織脂質(zhì)沉積情況，200倍光鏡下觀察。

2.4 脂肪組織過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR-γ）mRNA和蛋白表達(dá) 脂肪組織PPAR-γ mRNA表達(dá)采用Real-time PCR檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt）值表示目的基因PPAR-γ的表達(dá)水平。Western blot法檢測(cè)PPAR-γ蛋白表達(dá)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，使用ImageJ進(jìn)行灰度值計(jì)算。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，析用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 藏紅花水提液對(duì)高血脂癥金黃地鼠體質(zhì)量的影響 給藥開(kāi)始時(shí)，各組金黃地鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異；隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程，模型組體質(zhì)量呈現(xiàn)穩(wěn)步增長(zhǎng)趨勢(shì)，而實(shí)驗(yàn)組（低、中、高劑量）均呈現(xiàn)增長(zhǎng)較緩（見(jiàn)插頁(yè)圖1）。給藥4周后模型組（飼喂高脂飼料）體質(zhì)量顯著高于正常組（飼喂基礎(chǔ)飼料）（P＜0.01）。藏紅花水提物低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥組體質(zhì)量較之模型組分別下降了9.3%、7.1%、12.4%、11.2%，而各組間攝食量無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。

3.2 藏紅花水提液對(duì)高脂血癥金黃地鼠肝臟質(zhì)量的影響 給藥結(jié)束時(shí)，模型組金黃地鼠的肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)（肝重/體質(zhì)量）明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；藏紅花低、中、高劑量組金黃地鼠的肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)均較模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 2。

表1 四周給藥后各組金黃地鼠體質(zhì)量及攝食量比較（g

表1 四周給藥后各組金黃地鼠體質(zhì)量及攝食量比較（g

注：與正常組比較，*P＜0.01；藏紅花水提液低濃度組以 5g·kg-1·d-1濃度灌胃；中濃度組以10g·kg-1·d-1濃度灌胃；高濃度組以20g·kg-1·d-1濃度灌胃；陽(yáng)性藥組以15mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃；正常組和模型組以等體積生理鹽水灌胃

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表2 各組金黃地鼠肝臟質(zhì)量比較（g

表2 各組金黃地鼠肝臟質(zhì)量比較（g

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；藏紅花水提液低濃度組以5g·kg-1·d-1濃度灌胃；中濃度組以10g·kg-1·d-1濃度灌胃；高濃度組以20g·kg-1·d-1濃度灌胃；陽(yáng)性藥組以15mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃；正常組和模型組以等體積生理鹽水灌胃

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3.3 藏紅花水提液對(duì)高脂血癥金黃地鼠血脂代謝的影響 給藥4周后模型組金黃地鼠血清TG、TC、LDL-C水平，動(dòng)脈粥樣硬化及冠狀動(dòng)脈指數(shù)顯著高于正常組（P＜0.01），而 HDL-C（高密度脂蛋白）含量顯著低于正常組（P＜0.01）；與模型組相比，藏紅花水提液中、高劑量組及陽(yáng)性組血清TG、TC、LDL-C含量顯著降低，藏紅花水提液各劑量組及陽(yáng)性組HDL-C水平較模型組顯著增加，且動(dòng)脈粥樣硬化及冠狀動(dòng)脈指數(shù)顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)表 3。

3.4 藏紅花水提液對(duì)高脂血癥金黃地鼠血清AST、ALT水平的影響 給藥結(jié)束時(shí)，模型組金黃地鼠血清ALT、AST 水平較正常組顯著升高（P＜0.05），表明模型組金黃地鼠肝臟受損明顯；與模型組比較，藏紅花水提液中、高劑量組及陽(yáng)性組均能顯著降低血清AST水平（P＜0.01），藏紅花水提液高劑量組及陽(yáng)性組可顯著降低血清ALT水平（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

3.5 藏紅花水提液對(duì)高脂血癥金黃地鼠肝臟組織形態(tài)及脂滴沉積的影響 采用HE（蘇木精-伊紅）染色觀察肝臟組織形態(tài)變化，正常組金黃地鼠的肝組織完好，肝細(xì)胞排列整齊，胞間界限清晰，胞漿內(nèi)未見(jiàn)脂肪樣空泡；模型組金黃地鼠肝細(xì)胞腫脹，胞間界限不清，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)脂滴空泡；藏紅花水提液低、中、高三個(gè)劑量的藏紅花水提液均能使金黃地鼠肝組織結(jié)構(gòu)，脂滴空泡等情況有不同程度的改善，見(jiàn)插頁(yè)圖2。

表3 各組金黃地鼠血清TG、TC、HDL-C及LDL-C含量比較（mmol/L

表3 各組金黃地鼠血清TG、TC、HDL-C及LDL-C含量比較（mmol/L

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；TG：甘油三酯；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白；LDL-C：低密度脂蛋白；藏紅花水提液低濃度組以 5g·kg-1·d-1濃度灌胃；中濃度組以 10g·kg-1·d-1濃度灌胃；高濃度組以 20g·kg-1·d-1濃度灌胃；陽(yáng)性藥組以 15mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃；正常組和模型組以等體積生理鹽水灌胃

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表4 各組金黃地鼠肝功能指標(biāo)比較（U/L

表4 各組金黃地鼠肝功能指標(biāo)比較（U/L

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；AST：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶；藏紅花水提液低濃度組以 5g·kg-1·d-1濃度灌胃；中濃度組以 10g·kg-1·d-1濃度灌胃；高濃度組以 20g·kg-1·d-1濃度灌胃；陽(yáng)性藥組以 15mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃；正常組和模型組以等體積生理鹽水灌胃

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表5 各組金黃地鼠脂肪組織PPAR-γ比較，n=3）

表5 各組金黃地鼠脂肪組織PPAR-γ比較，n=3）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 γ（PPAR-γ）；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；藏紅花水提液低濃度組以5g·kg-1·d-1濃度灌胃；中濃度組以10g·kg-1·d-1濃度灌胃；高濃度組以20g·kg-1·d-1濃度灌胃；陽(yáng)性藥組以15mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃；正常組和模型組以等體積生理鹽水灌胃

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采用油紅O染色觀察金黃地鼠肝臟組織中脂質(zhì)的沉積情況，正常組肝臟未見(jiàn)明顯脂滴沉積，模型組肝臟可見(jiàn)明顯脂滴沉積，呈彌漫性；與模型組相比較，藏紅花水提液各劑量均可見(jiàn)肝臟脂滴沉積減少，且高劑量組較之其他兩個(gè)劑量組脂滴沉積明顯減少，見(jiàn)插頁(yè)圖3。

3.6 藏紅花水提液對(duì)高脂血癥金黃地鼠脂肪組織PPAR-γ影響 給藥后模型組脂肪組織PPAR-γ蛋白相對(duì)表達(dá)較正常組顯著降低（P＜0.01），藏紅花水提液干預(yù)后，中、高劑量組以及陽(yáng)性組肝組織PPAR-γ蛋白表達(dá)較模型組顯著增加（P＜0.05）。給藥后，與正常組相比，模型組PPAR-γ mRNA水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，藏紅花水提液各劑量組及陽(yáng)性組PPAR-γ mRNA表達(dá)水平具有不同程度增加，藏紅花水提液高劑量組及陽(yáng)性藥組PPAR-γ mRNA水平增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表5、插頁(yè)圖4。

4 討論

據(jù)報(bào)道，藏紅花有降血脂、抗腫瘤、抗氧化、改善心肌缺血缺氧、保護(hù)BPA（雙酚A）或者氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肝損傷等作用，但對(duì)于飲食性高脂血癥的肝臟保護(hù)作用鮮有報(bào)道[10-18]。本研究中，藏紅花水提液干預(yù)組體質(zhì)量增長(zhǎng)較模型組緩慢，肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)均較模型組低，而肝臟指數(shù)常用于評(píng)價(jià)肝臟脂肪變性程度，從HE和油紅O的染色結(jié)果也可以得出結(jié)論，藏紅花水提液干預(yù)后，高脂血癥金黃地鼠肝臟脂肪變性程度與脂滴沉積得以緩解。

與此同時(shí)，與模型組相比，藏紅花水提液（中、高劑量）血清TG、TC、LDL-C含量較模型組顯著降低，且動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)和冠狀動(dòng)脈指數(shù)較模型組顯著降低（P＜0.05），同時(shí)顯著提高血清 HDL-C 含量（P＜0.05），表明藏紅花水提液可調(diào)節(jié)高脂血癥金黃地鼠的血脂水平。Asdaq等[10]通過(guò)給高脂血癥大鼠灌胃（ig）藏紅花提取液 25、50、100mg·kg-1，發(fā)現(xiàn)藏紅花及其藏紅花素可以通過(guò)抑制自由基，顯著減緩高脂血癥大鼠血脂代謝紊亂現(xiàn)象，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性。

AST和ALT是反映肝功能異常的重要指標(biāo)。與模型組金黃地鼠相比，高劑量藏紅花水提液可降低血清中AST和ALT水平（P＜0.05），表示藏紅花水提液可能具有減輕高脂血癥金黃地鼠肝臟損傷的作用。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）是一類受過(guò)氧化物酶體增殖物激活的核受體，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用。PPAR-γ多存在于脂肪組織中，通過(guò)調(diào)控調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)影響糖脂代謝和脂肪形成等過(guò)程[19-21]。藏紅花水提液干預(yù)后，金黃地鼠脂肪組織PPAR-γ mRNA水平與蛋白表達(dá)較之模型組均顯著提高（P＜0.01）。

綜上所述，藏紅花水提液對(duì)于高脂血癥金黃地鼠的肝臟保護(hù)作用體現(xiàn)藏紅花水提液不僅調(diào)節(jié)血清內(nèi)血脂水平，且降低了金黃地鼠血清內(nèi)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶水平，改善肝臟組織脂肪變性和脂滴沉積。同時(shí)，藏紅花水提液干預(yù)后，金黃地鼠脂肪組織PPAR-γ mRNA和蛋白水平均有所提高，這可能是藏紅花改善高脂血癥金黃地鼠血脂水平，發(fā)揮肝臟保護(hù)作用的機(jī)制之一。