羅欽文，王媛，高兢，毛學(xué)英

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

0 引言

糖尿病是當(dāng)今社會(huì)一個(gè)重大的流行性疾病，其在全球的發(fā)病率連年升高，目前已成為世界上僅次于心腦血管疾病、腫瘤的第三位對(duì)人類健康有嚴(yán)重威脅的慢性疾病。國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的糖尿病地圖顯示，2017年全球已有4.25億人患有糖尿病，預(yù)計(jì)到2045年全球糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到6.29億。其中，中國的成人糖尿病患者數(shù)量高達(dá)1.14億，位居第一位[1]。糖尿病主要分為一型糖尿病、二型糖尿病和妊娠期糖尿病，其中二型糖尿病最為普遍，占發(fā)病總?cè)藬?shù)的90%～95%[2-3]。目前糖尿病的治療以西藥為主，主要包括：磺脲類、雙胍類、噻唑烷二酮類、二肽基肽酶-Ⅳ抑制劑等[4]。但是，這些藥物都存在一定的副作用，如體重增加、骨質(zhì)流失、胃腸道不良反應(yīng)等[5-6]。因此，安全、無副作用的天然活性物質(zhì)成為目前降糖研究的一大熱點(diǎn)。在眾多的天然活性物質(zhì)中，生物活性肽因其安全性高、不良副作用小、生物活性多樣化而最受關(guān)注[7-8]。羊乳作為一種天然營養(yǎng)食品，富含蛋白質(zhì)、維生素、脂肪和礦物質(zhì)，蛋白質(zhì)的氨基酸組成也與母乳極為接近[9]。在近年的研究中發(fā)現(xiàn)，羊乳及其蛋白肽具有多種生物活性，如抑菌、降血壓、抗氧化、抗癌[10-13]。但是，關(guān)于羊乳蛋白肽改善胰島素抵抗的研究尚未見諸報(bào)道。因此，本研究采用風(fēng)味蛋白酶水解羊乳酪蛋白制備羊乳酪蛋白酶解物，以葡萄糖利用率和細(xì)胞內(nèi)糖原含量為指標(biāo)評(píng)價(jià)其對(duì)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的改善效果，以期為羊乳蛋白及其活性肽的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Hep G2細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)院；羊乳粉（內(nèi)蒙古華頤樂牧業(yè)科技有限公司）；M EM培養(yǎng)基；胎牛血清；青鏈霉素雙抗溶液（100×）；非必需氨基酸（100×）；0.25%胰蛋白酶（Gbico）；風(fēng)味蛋白酶（諾維信公司）；葡萄糖測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；糖原測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 儀器設(shè)備

DK-8B型電熱恒溫水浴鍋，F(xiàn)E20型pH計(jì)，TGL-20 M型低溫高速離心機(jī)，LGJ-12型真空冷凍干燥機(jī)，MCO-17 AC二氧化碳培養(yǎng)箱，DK-98-Ⅱ2KW型超凈工作臺(tái)，SCIENTZ-ⅡD細(xì)胞超聲破碎儀，iMarkTMMicroplate Reader酶標(biāo)儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 羊乳酪蛋白酶解物制備

將羊乳酪蛋白水化，調(diào)節(jié)溫度為55℃，pH為7.0，按照質(zhì)量分散為5%酶與底物比加入風(fēng)味蛋白酶水解，于0.25，0.50，0.75，1，2，3，4，5h時(shí)取樣，85℃ 15 min滅酶，凍干，得到羊乳酪蛋白酶解物。

1.3.2 水解度測(cè)定[14]

采用三硝基苯磺酸（TNBS）法測(cè)定羊乳酪蛋白酶解物的水解度。吸取0.5 mL的已滅酶的樣品，冷卻并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用1%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液定容靜置。取0.125 mL酶解液的SDS溶液與1 mL磷酸緩沖液（pH 8.2，0.2 mol/L）和1 mL的0.1%的TNBS溶液振蕩混合，于50℃水浴避光反應(yīng)60 min，反應(yīng)完畢之后，加入2 mL 0.1mol/L的HCl立即終止反應(yīng)，室溫放置30 min后，于420 nm下測(cè)定其吸光度值。0～5.0×10-3mol/L L-亮氨酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照公式(1)計(jì)算水解度。

式中：h——水解物中每克被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)（m eq/g protein）

htot——每克原料蛋白質(zhì)中的總的肽鍵毫摩爾數(shù)，酪蛋白為8.2 m eq/g protein

1.3.3 高濃度葡萄糖刺激H ep G2細(xì)胞建立胰島素抵抗模型[15]

將HepG2細(xì)胞以1×105個(gè)/μL的密度接入細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁生長24 h后，加入終濃度為30 mmol/L的葡萄糖溶液，孵育24 h。最后加入終濃度為100 nmol/L的胰島素刺激30 min，即成功建立高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的Hep G2細(xì)胞胰島素抵抗模型。

1.3.4 HepG2細(xì)胞葡萄糖利用率測(cè)定

采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測(cè)定葡萄糖含量。將HepG2細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接入96孔板中，貼壁24h。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞添加刺激物和蛋白酶解物（終濃度為1.0 mg/mL），模型對(duì)照組添加刺激物，空白對(duì)照組添加等體積無菌PBS緩沖液，孵育24h。最后加入終濃度為100 nmol/L的胰島素刺激細(xì)胞30 min，吸取上層培養(yǎng)基，用葡萄糖測(cè)定試劑盒測(cè)定葡萄糖濃度，按公式二計(jì)算細(xì)胞葡萄糖利用率。

公式二：葡萄糖利用率（%）=(C1+C 2-C 3)/(C 1+C 2)×100%

式中：C 1—原培養(yǎng)基中葡萄糖含量（5.55 mmol/L）；

C 2—葡萄糖添加量；

C 3—上層培養(yǎng)基中的葡萄糖含量（mmol/L）

1.3.5 HepG2細(xì)胞內(nèi)糖原含量測(cè)定

將Hep G 2細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接入96孔板中，貼壁24 h。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞添加刺激物和蛋白酶解物（終濃度為1.0 mg/mL），模型對(duì)照組添加刺激物，空白對(duì)照組添加等體積無菌PBS緩沖液孵育。最后加入終濃度為100 nmol/L的胰島素刺激細(xì)胞，吸取上層培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，按照糖原測(cè)定試劑盒步驟測(cè)定細(xì)胞中的糖原含量。

1.3.6 體外模擬胃腸消化[16]

將羊乳酪蛋白酶解物溶于蒸餾水中，用1mol/L HC l調(diào)節(jié)p H值至2.0。加入胃蛋白酶（酶與底物質(zhì)量比為1：40），在37℃下振蕩孵育1.5 h。孵育結(jié)束后，取出一半溶液，80℃加熱20 min，凍干后得到胃消化樣品。另一半溶液用1 mol/L N aOH調(diào)節(jié)pH至7.5，加入胰酶（酶與底物質(zhì)量比為1∶100），在37℃下振蕩孵育2.5 h。之后溶液在80℃加熱20 min，凍干后得到胃腸消化樣品。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行one-way ANOVA和Duncan's multiple-comparison test分析組間差異，以P〈0.05為顯著性，各組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊乳酪蛋白酶解物對(duì)高糖刺激Hep G2細(xì)胞葡萄糖利用率的影響

利用風(fēng)味蛋白酶水解羊乳酪蛋白，不同時(shí)間酶解產(chǎn)物的水解度及其對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型葡萄糖利用率的影響如圖1所示。隨著酶解時(shí)間的延長，羊乳酪蛋白酶解物的水解度逐漸增加。當(dāng)濃度為0.25 mg/mL時(shí)，與羊乳酪蛋白處理組細(xì)胞相比，羊乳酪蛋白風(fēng)味蛋白酶酶解物處理組細(xì)胞的葡萄糖利用率顯著升高，表現(xiàn)出一定的改善胰島素抵抗的作用。這說明風(fēng)味蛋白酶的酶解作用促進(jìn)了羊乳酪蛋白中活性序列的釋放。其中3 h酶解產(chǎn)物作用的細(xì)胞葡萄糖利用率最高，達(dá)到51.9±0.3%，與原蛋白處理組細(xì)胞相比提高了29.5%。因此，我們選用風(fēng)味蛋白酶3 h酶解產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 羊乳酪蛋白酶解物（風(fēng)味蛋白酶,3 h）水解度及對(duì)高糖刺激HepG2細(xì)胞葡萄糖利用率的影響

2.2 羊乳酪蛋白酶解物對(duì)高糖刺激HepG2細(xì)胞糖原含量的影響

羊乳酪蛋白酶解物對(duì)高糖刺激Hep G2細(xì)胞內(nèi)糖原含量的影響如圖2所示。30 mmol/L葡萄糖刺激Hep G2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的糖原含量降低至空白對(duì)照組的61.9±2.9%。而0.25，0.5，1.0 mg/mL羊乳酪蛋白酶解物處理則顯著提高了細(xì)胞內(nèi)的糖原含量且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)（分別為空白對(duì)照組的70.3±2.5%，72.7±4.7%，83.3±4.0%）。說明羊乳酪蛋白酶解物能夠促進(jìn)高糖刺激的HepG2細(xì)胞糖原合成，進(jìn)而促使葡萄糖轉(zhuǎn)化為糖原，從而提高葡萄糖利用率。

圖2 羊乳酪蛋白酶解物（風(fēng)味蛋白酶,3 h）對(duì)高糖刺激HepG2細(xì)胞內(nèi)糖原含量的影響

2.3 模擬胃腸消化作用對(duì)羊乳酪蛋白酶解物促進(jìn)葡萄糖利用活性的影響

胃腸模擬消化作用對(duì)羊乳酪蛋白酶解物促進(jìn)葡萄糖利用活性的影響如圖3所示。當(dāng)采用終濃度為0.25，0.5，1.0 mg/mL羊乳酪蛋白酶解物處理細(xì)胞后，胰島素抵抗模型細(xì)胞的葡萄糖利用率顯著升高，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。羊乳酪蛋白酶解物經(jīng)模擬胃消化、模擬胃腸消化后，其促進(jìn)葡萄糖利用的活性并未發(fā)生明顯改變。

圖3 胃腸模擬消化作用對(duì)羊乳酪蛋白酶解物促進(jìn)葡萄糖利用活性的影響

2.4 模擬胃腸消化作用對(duì)羊乳酪蛋白酶解物促進(jìn)糖原合成活性的影響

胃腸模擬消化作用對(duì)羊乳酪蛋白酶解物促進(jìn)糖原合成活性的影響如圖4所示。當(dāng)采用終濃度為0.25，0.5，1.0 mg/mL羊乳酪蛋白酶解物處理細(xì)胞后，胰島素抵抗模型細(xì)胞的糖原含量顯著升高，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。羊乳酪蛋白酶解物經(jīng)模擬胃消化、模擬胃腸消化后，其促進(jìn)糖原合成的活性并未發(fā)生明顯改變。

圖4 胃腸模擬消化作用對(duì)羊乳酪蛋白酶解物促進(jìn)糖原合成活性的影響

3 討論

糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的代謝性疾病，可導(dǎo)致神經(jīng)病變、腎病、視網(wǎng)膜病變以及心血管疾病等一系列的并發(fā)癥[17]。在機(jī)體內(nèi)，肝臟是攝取、儲(chǔ)存、合成和分解葡萄糖的主要場(chǎng)所，在維持血糖穩(wěn)定過程中起著非常重要的作用[18]。在糖尿病患者體內(nèi)，肝臟代謝發(fā)生改變，胰島素對(duì)糖原合成的促進(jìn)作用和對(duì)糖異生的抑制作用降低，出現(xiàn)胰島素抵抗，進(jìn)而造成高血糖癥[19]。已有多項(xiàng)研究表明，生物活性肽具有肝臟胰島素抵抗的功能。Boonloh等人研究了米糠蛋白水解物（RBP）對(duì)Hep G2細(xì)胞胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RBP緩解了胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下Hep G2細(xì)胞的葡萄糖利用損傷，抑制了炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)了AM PK信號(hào)通路的激活[20]。Song等人通過體外實(shí)驗(yàn)研究表明，來源于酪蛋白糖巨肽的肽段IPPKKNQKTE能通過激活A(yù)M PK信號(hào)通路提高Hep G2肝細(xì)胞葡萄糖攝取和糖原合成水平，降低糖異生水平，進(jìn)而改善肝細(xì)胞胰島素抵抗[15]。與以往的研究結(jié)果類似，在本實(shí)驗(yàn)中，羊乳酪蛋白酶解物有效促進(jìn)了高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的Hep G2細(xì)胞的葡萄糖利用和糖原合成（圖1-圖2），說明其具有良好的體外改善胰島素抵抗活性。

生物活性肽由氨基酸組成，對(duì)存在于胃腸道中的蛋白酶具有非常強(qiáng)的敏感性，經(jīng)胃腸道消化后，其活性會(huì)減弱或增強(qiáng)[21]。因此，在生物活性肽開發(fā)利用過程中，胃腸消化穩(wěn)定性研究至關(guān)重要。體外模擬胃腸消化模型（SGM）是目前公認(rèn)的一種初步確定肽的生物利用度的方法[22]。因此，在本研究中，我們測(cè)定了體外模擬胃腸消化后羊乳酪蛋白酶解物促進(jìn)Hep G2細(xì)胞葡萄糖利用和糖原合成活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過胃消化、胃腸消化的羊乳酪蛋白酶解物處理組細(xì)胞與未經(jīng)消化的羊乳酪蛋白酶解物處理組細(xì)胞相比，其葡萄糖利用率和細(xì)胞內(nèi)糖原含量并無顯著變化（圖3-圖4）。說明在胃腸消化過程中，羊乳酪蛋白酶解物改善胰島素抵抗的活性并沒有破壞。

4 結(jié)論

本研究證明羊乳酪蛋白酶酶解物對(duì)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗具有良好的改善效果。當(dāng)濃度為0.25 m g/m L時(shí)，羊乳酪蛋白風(fēng)味蛋白酶酶解物處理組細(xì)胞葡萄糖利用率顯著高于羊乳酪蛋白原蛋白處理組細(xì)胞；羊乳酪蛋白酶解物還能顯著提高HepG2細(xì)胞胰島抵抗模型細(xì)胞內(nèi)的糖原含量。體外模擬胃腸消化作用對(duì)羊乳酪蛋白酶解物促進(jìn)葡萄糖利用和糖原合成的活性并無顯著影響。本研究結(jié)果可為羊乳酪蛋白源生物活性肽的開發(fā)提高一定的理論依據(jù)。在后續(xù)研究中，本課題組將對(duì)羊乳酪蛋白酶解物進(jìn)行分離純化，鑒定活性氨基酸序列，并對(duì)其改善胰島素抵抗的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。