項海東，田松波，陳惠珍

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 口腔內(nèi)科，河北 石家莊 050000）

牙髓干細胞（dental pulp stem cells, DPSCs）來自于成年機體的牙髓組織，是具有多向分化潛能和自我更新的未分化細胞。正常情況下，DPSCs處于靜息狀態(tài)，維持牙髓中細胞的功能及新舊交替的穩(wěn)態(tài)，當牙髓中的成牙本質(zhì)細胞受到損傷后，DPSCs可參與牙髓的修復(fù)與重建。因此，DPSCs被認為是影響牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體形成的理想種子細胞[1-2]。目前已發(fā)現(xiàn)多種在體內(nèi)及體外影響DPSCs增殖及分化的因素。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin, PRF）是新一代的血小板濃縮制品，富含血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子等多種生長因子，這些因子可構(gòu)成強大的組織修復(fù)功能調(diào)節(jié)系統(tǒng)，目前已被應(yīng)用于基礎(chǔ)細胞的研究[3-4]。但PRF對DPSCs的影響及機制尚不清楚。因此，本研究旨在探討PRF對DPSCs的增殖、分化、凋亡的影響及機制，以期為牙髓再生帶來新的契機。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Gibco公司，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、青鏈霉素購自美國Sigma公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）試劑盒、細胞計數(shù)試劑盒（cell counting Kit-8,CCK8）、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫/碘化丙錠（propidium iodide, PI）凋亡試劑盒均購自中國碧云天生物技術(shù)研究所，活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Cleaved Caspase-3）、p38、p-p38單克隆抗體及辣根過氧化物標記的二抗均購自美國abcam公司，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，Trizol購自美國Invitrogen公司。RT-PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國SIM公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，酶標儀、電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 人牙髓干細胞（hDPSCs）的分離培養(yǎng)

收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科志愿者（16～25歲）阻生第3磨牙，即刻放入預(yù)冷及加入青鏈霉素雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)保存。無菌條件下取出牙髓組織，用0.01 mol/L的PBS清洗2次，小剪刀將牙髓組織剪成1～2 mm的小組織塊，按照1∶1比例加入0.4%的分散酶和0.3%的Ⅰ型膠原酶，37℃消化1 h，輕輕吹打離散單細胞團塊，過70 μm的細胞篩網(wǎng)，1 000 r/min離心5 min，0.01 mol/L的PBS清洗1遍。細胞沉淀用高糖DMEM培養(yǎng)基（含20%的胎牛血清）重懸，以1×105個/ml密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換液1次，細胞生長密度達到80%～90%時，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后傳代。收集生長至對數(shù)期的第2代hDPSCs進行純化后再用于后續(xù)的實驗研究。

1.3 PRF的制備

血液來自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科10例健康的志愿者，平均26歲（22～28歲），均簽署知情同意書。無菌條件下每個志愿者抽取5 ml靜脈血于真空管中，3 000 r/min離心10 min，靜置數(shù)分鐘后，棄去上清，收集中間層（中間層為PRF），將PRF凝膠與試管底部的紅細胞分離出來，所獲得的PRF膜用來制備滲出液。將PRF膜放置在預(yù)先盛有2 ml/孔的DMEM培養(yǎng)基的6孔板中，1孔/板，培養(yǎng)板置于孵育箱中繼續(xù)孵育，4℃放置7 d后收集6孔板中的培養(yǎng)液，3 000 r/min離心15 min以沉淀紅血細胞，然后使用0.22 μm的無菌濾器過濾除菌。將收集的PRF浸出液分裝，置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細胞增殖檢測

hDPSCs隨機分為對照組及實驗組。將第3代hDPSCs以1×104個/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，37℃，5% CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第1、3、5及7天時，每孔細胞中加入10 μl的CCK-8溶液，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標儀在490 nm波長處測定并記錄各組的光密度（OD）值。計算細胞存活率，細胞存活率=（實驗組A/對照組A）×100%。

1.5 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測

hDPSCs隨機分為對照組及實驗組。每組設(shè)置第 0、3、7、14天4個時間點。以2×104個/ml的密度將生長至對數(shù)期的第4代hDPSCs的單細胞懸液接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至相應(yīng)時間后，用Trizol法提取細胞中的總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，RT-PCR檢測ALP的mRNA表達。ALP引物序列：正向：5'-GGCTGGA GATGGACAAGTTC-3'，反向：5'-CTCGTTTCCCTGAGT CGTGT-3'；GAPDH引物序列：正向：5'-AAGAGTGGG TTTAAGTGGAAGGCT-3'，反向：5'-GAAGATGGTGAT GGGATTTC-3'。PCR反應(yīng)參數(shù)：A，預(yù)變性 95℃10 min；B，變性95℃ 10 s；退火60℃ 15 s，延伸72℃ 20 s，共40個循環(huán)；C，72℃ 15 min。4℃終止反應(yīng)。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，取均值采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析。

1.6 細胞凋亡檢測

收集按照上述分組培養(yǎng)第7天的細胞，預(yù)冷的PBS及結(jié)合緩沖液各洗滌細胞1次后，離心棄上清，加入400 μl的結(jié)合緩沖液重懸細胞，細胞沉淀加入5 μl的PI和Annexin-V-FITC，充分混勻后置于室溫下避光孵育10～15 min，離心沉淀細胞，緩沖液洗滌細胞1次，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 Western blotting檢 測 Cleaved Caspase-3、p38、p-p38蛋白表達

收集按照上述分組培養(yǎng)第7天的細胞，按照細胞蛋白提取試劑盒提取細胞中的蛋白，BCA試劑盒檢測提取的蛋白質(zhì)量。將蛋白樣品與上樣緩沖液等量混勻后置于100℃變性10 min，依次進行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育Cleaved Caspase-3、p38、p-p38 1∶400稀釋，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH），1∶1 000稀釋、二抗孵育辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，1∶1 000稀釋，37℃孵育1 h，洗膜3次，ECL發(fā)光劑顯影，自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參，分析Cleaved Caspase-3、p38、p-p38的蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，兩組多時間點的比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFR對hDPSCs增殖的影響

對照組在第0、1、3、5及7天的OD值分別為（0.18±0.04）、（0.25±0.06）、（0.36±0.07）、（0.48±0.08）、（0.63±0.09），實驗組在第 0、1、3、5 及 7 天的 OD 值分別為（0.20±0.05）、（0.28±0.07）、（0.59±0.08）、（0.73±0.09）、（0.90±0.08）。對照組與PRF組第0、1、3、5及7天的OD值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的OD值有差異（F=13.243，P=0.000）；②對照組與PRF組OD值有差異（F=17.276，P=0.000）；③對照組與PRF組OD值變化趨勢有差異（F=19.417，P=0.000）。見圖1。

圖1 PFR對hDPSCs增殖的影響 （±s）

2.2 PFR對hDPSCs礦化相關(guān)基因ALP表達的影響

對照組在第0、3、7及14天ALP mRNA表達分別為（0.883±0.112）、（1.231±0.163）、（1.624±0.152）、（1.913±0.164），實驗組分別為（0.925±0.144）、（1.284±0.192）、（2.422±0.321）、（2.695±0.371），兩組第 0、3、7及14天ALP mRNA表達比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點間ALP mRNA表達有差異（F=17.191，P=0.000）；②兩組ALP mRNA表達有差異（F=19.841，P=0.000）；③兩組ALP mRNA表達變化趨勢有差異（F=18.358，P=0.000）。見圖2。

圖2 PFR對hDPSCs的ALP mRNA表達的影響 （±s）

2.3 PFR對hDPSCs凋亡的影響

實驗組細胞的凋亡率（4.18±0.67）%較對照組（13.21±1.02）% 下降（t=12.816，P=0.000）。見圖 3。

圖3 PFR對hDPSCs凋亡的影響

2.4 PFR對Cleaved Caspase-3、p38、p-p38蛋白表達的影響

對照組Cleaved Caspase-3、p38、p-p38的蛋白表達分別為（0.162±0.023）、（0.668±0.046）、（0.041±0.016），實驗組Cleaved Caspase-3、p38、p-p38的蛋白表達分別為（0.063±0.016）、（0.681±0.051）、（0.174±0.019），實驗組Cleaved Caspase-3蛋白表達較對照組下調(diào)（t=0.120，P=0.004）、p-p38蛋白表達上調(diào)（t=9.274，P=0.001），p38蛋白在兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.328，P=0.760）。見圖 4。

圖4 PFR對Cleaved Caspase-3、p38、p-p38蛋白表達的影響

3 討論

近些年來，利用干細胞治療已成為再生醫(yī)學(xué)研究的熱點[5]。干細胞可分為成體干細胞和胚胎干細胞。DPSCs是成體干細胞的一員，可分化為脂肪干細胞和神經(jīng)干細胞，也可形成牙本質(zhì)牙髓細胞。牙本質(zhì)牙髓細胞是未來牙形成的第一步，這也說明DPSCs在活髓的保存及治療中有臨床應(yīng)用價值及潛在的優(yōu)勢[5]。PRF是繼富血小板血漿（platelet rich plasma, PRP）后的新一代血小板濃縮制品，富含纖維蛋白原、多種生長因子及高濃度的血小板，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞、成骨細胞等的增殖、分化等過程[6]。研究顯示，PRF可在體外促進牙槽骨成骨細胞的增殖及分化，可以不同的方式促進犬DPSCs的增殖及分化[7-8]。ALP是一種磷酸單酯水解酶，是成骨細胞成熟的早期標志物之一，參與骨的形成及代謝過程，其活性的增強是DPSCs向成牙本質(zhì)細胞分化的早期標志[9]。本研究結(jié)果顯示，PRF可促進DPSCs的增殖和分化。

細胞凋亡過程受到Caspase家族的調(diào)控，Caspase-3是Caspase家族的一員，是細胞凋亡通路中關(guān)鍵性的活化酶，處在Caspase級聯(lián)反應(yīng)的下游，其激活可導(dǎo)致細胞的凋亡[10]。研究顯示，Caspase-3的激活可引起DPSCs的凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示，PRF可抑制DPSCs的凋亡及下調(diào)Cleaved Caspase-3蛋白表達。

絲裂原活性蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）屬于絲蛋白/蘇氨酸激酶，參與細胞的增殖及死亡、基因表達調(diào)控等過程，在多種信號的傳遞過程中有重要作用[12]。p38 MAPK信號通路是MAPK信號通路家族中重要一員，參與牙髓干細胞向成牙本質(zhì)細胞分化等過程[13]。研究顯示，阿司匹林可通過抑制p38 MAPK信號通路抑制DPSCs的增殖及分化[14]。p38 MAPK信號通路抑制劑可抑制ALP的活性和成牙本質(zhì)樣細胞的分化，在初期牙本質(zhì)及第3期反應(yīng)性牙本質(zhì)形成過程中，可發(fā)現(xiàn)p38 MAPK信號通路的激活[15]。本研究結(jié)果顯示，PRF可上調(diào)p-p38蛋白的表達。

綜上所述，PRF可通過激活p38信號通路促進hDPSCs的增殖，上調(diào)ALP mRNA表達，抑制其凋亡。該研究為牙髓損傷修復(fù)及再生帶來了新的思路。