生欣，王俊華，劉月華，郜雙林，謝夏丹，范芳

（遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563000）

蓬亂蛋白（Dishevelled, DVL）是一類穿梭于胞質(zhì)和細(xì)胞核的Wnt信號(hào)通路蛋白，能夠與多種蛋白相互作用，將Wnt信號(hào)由膜受體Frizzled傳遞至下游組件[1]。DVL最早發(fā)現(xiàn)于果蠅體毛和翅毛異常定位表型中，在進(jìn)化上高度保守[2]。目前在人類中已知的DVL有3個(gè)亞型（DVL1，DVL2和DVL3），均具有3個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，即N-端的DIX結(jié)構(gòu)域、內(nèi)部的PDZ結(jié)構(gòu)域和C-端的DEP結(jié)構(gòu)域[3-4]。該蛋白不僅參與細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，而且與胚胎發(fā)育、細(xì)胞極性、分化及腫瘤發(fā)生等過程相關(guān)[5-6]。盡管通過結(jié)構(gòu)域特征能夠預(yù)測其功能，但是該蛋白在不同組織和細(xì)胞中確切的生物學(xué)功能還不清楚[7]。

近年來，大量研究顯示W(wǎng)nt信號(hào)通路參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[8-9]。Wnt5α能夠通過經(jīng)典Wnt信號(hào)通路引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[10-11]，且該通路過度激活能夠?qū)е缕交〖?xì)胞增殖和血管內(nèi)膜增厚[12-13]，但有關(guān)DVL在該過程中的作用還未見報(bào)道。本課題組在動(dòng)脈粥樣硬化的體內(nèi)外模型中觀察到DVL2的異常表達(dá)，然而，其具體的作用機(jī)制還不清楚。相比常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，慢病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)⒉《净蚪M整合到宿主基因組，從而實(shí)現(xiàn)長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，且具有能夠感染非分裂期細(xì)胞、產(chǎn)生免疫反應(yīng)小、可插入大片段外源基因等優(yōu)點(diǎn)，成為導(dǎo)入外源基因的有利工具，并被廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞系、原代細(xì)胞和干細(xì)胞的基因過表達(dá)、RNA干擾、microRNA研究，以及基因缺陷型動(dòng)物模型復(fù)制等研究中[14]。因此，本研究擬構(gòu)建DVL2的慢病毒干擾和過表達(dá)載體，建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells,hUVECs）的穩(wěn)定表達(dá)株，并在體外研究其對(duì)DVL2基因表達(dá)的影響，以期為進(jìn)一步探索DVL2在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生早期的作用及其蛋白互作關(guān)系奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的慢病毒系統(tǒng)pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-puro、pHB-U6-CMV-MCS-PGKZsGreen-puro、感受態(tài)DH5α細(xì)胞均由遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室保存，hUVECs、HEK 293T細(xì)胞株和含有生長因子的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），pSPAX2、pMD2G（美國Addgene公司），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、DMSO、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、T4連接酶、質(zhì)粒提取與純化試劑盒PureLinkTMHiPure Plasmid Maxiprep Kit、DNA Polymerease、DNA ladder、 蛋 白Marker（美國Thermo Fisher Scientific公司），載體回收試劑盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（日本TaKaRa公司），凝膠回收試劑盒、BCA定量試劑盒（北京天根生化科技有限公司），PCR引物、瓊脂糖、瓊脂粉（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 目的基因h-DVL2CDS區(qū)域的擴(kuò)增 提取hUVECs細(xì)胞基因組DNA，設(shè)計(jì)正向引物h-DVL2-Eco/Eco-F（5'-GGATCTATTTCCGGTGAATTCGCCACCATG GCGGGTAGCAGCACTG-3'）和反向引物h-DVL2-Eco/Eco-R（5'-TCTAGAACTAGTCTCGAGCATAACATCCA CAAAGAACTCGCT-3'）。以基因組DNA為模板擴(kuò)增合成目的基因h-DVL2的CDS區(qū)域，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5 min，94℃變性20 s，55℃退火 20 s，72℃ 延伸150 s，共27個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min；PCR產(chǎn)物電泳回收純化，測序分析。

1.2.2 干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和引物合成 以人DVL2基因的mRNA序列（GeneBank Accession No.NM_004422.2）根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)shRNA靶序列和對(duì)照病毒載體（見表1、2）。合成引物，分別稀釋至100 μmol，引物退火（95℃ 10 min，75℃ 10 min，55℃ 10 min，35℃ 10 min，15℃ 10 min）形成帶黏性末端的雙鏈片段，退火處理后得到shRNA模板用于連接反應(yīng)。

1.2.3 過表達(dá)和干擾表達(dá)載體的構(gòu)建 分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切目的基因和慢病毒載體，將目的基因與線性化慢病毒過表達(dá)載體pHBLVCMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-puro連接，插入MCS區(qū)，獲得重組過表達(dá)質(zhì)粒pHBLV-HDVL2。將shRNA模板與線性化的慢病毒干擾載體pHB-U6-CMVMCS-PGK-ZsGreen-puro連接，插入U(xiǎn)6啟動(dòng)子后，獲得重組干擾質(zhì)粒pHB-shRNA-HDVL2。分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，通過菌液PCR鑒定，將陽性克隆菌液測序分析。

1.2.4 重組表達(dá)h-DVL2慢病毒在HEK293T細(xì)胞中的包裝和轉(zhuǎn)染 采用3質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行病毒包裝，包括慢病毒穿梭質(zhì)粒，即已經(jīng)制備的重組慢病毒質(zhì)粒pHBLV-HDVL2/pHB-shRNA-HDVL2，2種輔助包裝原件質(zhì)粒，即pSPAX2和pMD2G。采用高純度無內(nèi)毒素抽提3種質(zhì)粒載體，濃度達(dá)到1 μg/μl，A260/280在1.7～1.8用于病毒包裝。以Lipofectamine 2000脂質(zhì)體同時(shí)將3質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換含10% FBS的新鮮完全培養(yǎng)基。在48 h時(shí)，收集1次培養(yǎng)基，補(bǔ)入新鮮完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，在72 h收集所有培養(yǎng)基，離心去除細(xì)胞碎片，收集病毒原液于超速離心管中，4℃、22 206 r/min離心120 min，分裝病毒超離液，置入-80℃冰箱冷凍保存。

表1 靶向DVL2基因的shRNA寡核苷酸單鏈

表2 對(duì)照病毒載體siRNA寡核苷酸單鏈

1.2.5 病毒滴度測定 HEK293T細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度種96孔板，100 μl/孔，每個(gè)病毒準(zhǔn)備6孔，37℃，5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將10 μl病毒液做3倍梯度稀釋，共6個(gè)稀釋度，分別加到對(duì)應(yīng)的孔中，并追加培養(yǎng)基至100 μl；48 h后，換液為100 μl含1.5 μg/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基；24 h后，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，活細(xì)胞工作站觀察熒光，熒光百分比在10%～30%的孔計(jì)算病毒滴度；滴度（TU/ml）=細(xì)胞數(shù)×熒光百分比×MOI×病毒稀釋倍數(shù)×103。

1.2.6 慢病毒感染hUVECs 以1×105個(gè)/ml的密度接種hUVECs到6孔板，細(xì)胞融合度在50%～70%更換含有聚凝胺（終濃度為6 μg/ml）的適應(yīng)性培養(yǎng)基，根據(jù)病毒滴度和細(xì)胞量加入相應(yīng)體積的病毒原液；感染后24 h，換無病毒的適應(yīng)性培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，活細(xì)胞工作站觀察，絕大部分細(xì)胞感染病毒以后，利用嘌呤霉素抗性篩選掉未感染病毒的細(xì)胞；換嘌呤霉素濃度為8 μg/ml的適應(yīng)性培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1周，直至沒有感染病毒的細(xì)胞被嘌呤霉素殺光，將嘌呤霉素濃度降低到4 μg/ml繼續(xù)培養(yǎng)1周，使細(xì)胞慢病毒感染穩(wěn)定傳代；由于感染效率高，穩(wěn)定性好，故不需要進(jìn)行挑取單克隆操作，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后即可正常使用。將感染好的細(xì)胞分為BC組（hUVECs空白對(duì)照）、NC組（HBLV-GFP-PURO陰性對(duì)照）、干擾組（pHB-shRNA-HDVL2）及過表達(dá)組（pHBLVHDVL2）。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測mRNA相對(duì)表達(dá)量 參照試劑盒說明書，分別以RNAiso Plus提取總RNA，以Prime ScriptTMRT Master Mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃預(yù)反應(yīng)15 min；85℃擴(kuò)增5 s。引物序列見表3。參照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃ 退火30 s。共40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

表3 qRT-PCR引物序列

1.2.8 Western blotting檢測蛋白的相對(duì)表達(dá)量 細(xì)胞消化裂解，提取蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白定量，以5×蛋白Loading buffer按4∶1充分混合，100℃煮沸10 min變性蛋白。每孔按BC組、NC組、干擾組、過表達(dá)組順序各上25 μg蛋白樣品溶液。80 V恒壓電泳，200 mA電轉(zhuǎn)120 min；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，1×TBST，清洗6次，每次5 min；分別以兔抗人DVL2（1∶1 000）和小鼠抗人GAPDH一抗（1∶10 000）4℃，過夜孵育，1×TBST清洗；分別以山羊抗兔和兔抗小鼠二抗（1∶3 000），室溫孵育2 h，1×TBST清洗；以Chemi DocTMtouch imaging System（BIO-RAD）檢測蛋白條帶ECL化學(xué)發(fā)光顯色，以ImageLab軟件檢測蛋白條帶灰度值，目的蛋白的相對(duì)含量=目的條帶灰度值/對(duì)應(yīng)GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，其兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，每個(gè)樣本每次檢測做3個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 pHBLV-HDVL2過表達(dá)慢病毒載體鑒定結(jié)果

將轉(zhuǎn)化后的陽性克隆菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見整齊均一的條帶（見圖1A～D），對(duì)照DNA Marker進(jìn)一步確定陽性克隆，菌液送檢進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果顯示插入序列與構(gòu)建的目的片段堿基序列完全一致（見圖1E），質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 h-DVL2 shRNA慢病毒載體鑒定結(jié)果

將構(gòu)建的腺病毒干擾載體pHB-shRNA-HDVL2酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定（見圖2A、B），膠回收。將重組的陽性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得單一產(chǎn)物，將產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果見圖2C。測序峰圖（見圖2D）顯示在測序結(jié)果的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，干擾序列正確。其干擾序列峰形圖均為單峰，無突變pHB-shRNA-HDVL2構(gòu)建成功。

2.3 慢病毒載體的包裝及滴度測定結(jié)果

慢病毒載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，熒光百分比在10%～30%的孔計(jì)算病毒滴度（見圖3），NC組、干擾組、過表達(dá)組滴度分別為2×108、2×108和1×108TU/ml。

圖1 pHBLV-HDVL2過表達(dá)載體的構(gòu)建和測序結(jié)果

圖2 pHB-shRNA-HDVL2 shRNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建和測序結(jié)果

2.4 慢病毒感染hUVECs的感染率

慢病毒感染hUVECs后，利用puro+抗性基因，加puromycin篩選掉未感染細(xì)胞。通過Image J分析得感染率＞98%（感染率=帶熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）（見圖 4）。

2.5 DVL2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

各組DVL2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較顯示，NC組中DVL2 mRNA相對(duì)表達(dá)量與BC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.910，P=0.129）；干擾組DVL2 mRNA相對(duì)表達(dá)量較BC組降低（t=28.369，P=0.000），沉默效率為67%；過表達(dá)組中DVL2 mRNA相對(duì)表達(dá)量增加（t=-5.641，P=0.005），過表達(dá)水平為NC組的5.6倍。

各組DVL2蛋白表達(dá)比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；BC和NC組中可見DVL2條帶較細(xì)，而過表達(dá)組較粗。進(jìn)一步兩兩比較顯示，NC組中DVL2蛋白表達(dá)較BC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.031，P=0.977）；干擾組DVL2灰度較BC組降低（t=37.025，P=0.000），干擾效率為61%；過表達(dá)組中DVL2蛋白表達(dá)增加（t=-13.004，P=0.000），表達(dá)水平為BC組的2.7倍。見圖5和表4。

圖3 慢病毒滴度測定圖 （×100）

圖4 慢病毒感染hUVECs熒光鑒定圖 （×100）

圖5 各組DVL2 mRNA和蛋白表達(dá)比較

表4 DVL2 mRNA和蛋白表達(dá)比較（n =3，±s）

表4 DVL2 mRNA和蛋白表達(dá)比較（n =3，±s）

注：?與BC組比較，P ＜0.05

組別 DVL2 mRNA DVL2蛋白BC 組 1.000±0.000 1.000±0.000 NC 組 0.930±0.005 0.987±0.009干擾組 0.301±0.006? 0.380±0.004?過表達(dá)組 5.684±0.043? 2.726±0.023?F值 35.767 222.458 P值 0.000 0.000

3 討論

本研究首先構(gòu)建DVL2過表達(dá)和干擾慢病毒表達(dá)載體pHBLV-HDVL2和pHB-shRNA-HDVL2，即穿梭質(zhì)粒，酶切和測序結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功。進(jìn)一步采用3質(zhì)粒系統(tǒng)，將表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒pSPAX2和pMD2G共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝形成具有感染能力的慢病毒顆粒。由于表達(dá)載體攜帶有ZsGreen綠色熒光蛋白基因，較常規(guī)的EGFP熒光更為穩(wěn)定，通過熒光顯微鏡觀察能夠獲得病毒包裝的滴度和轉(zhuǎn)染效率。原代細(xì)胞為較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，本研究通過慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，能夠?qū)y帶DVL2的過表達(dá)和干擾shRNA序列整合到原代hUVECs基因組中，并通過puromycin篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，獲得較高的轉(zhuǎn)染效率（＞98%）。與BC組比較，過表達(dá)組的DVL2表達(dá)增加，而干擾組的DVL2表達(dá)水平下調(diào)?？梢姡狙芯砍晒Λ@得了DVL2的干擾和過表達(dá)慢病毒載體，并能夠在原代hUVECs細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

Wnt信號(hào)通路是由分泌型糖蛋白Wnt激活的一系列信號(hào)通路，包括經(jīng)典的Wnt/β-caternin信號(hào)通路，非經(jīng)典的Wnt/PCP信號(hào)通路和Wnt/Ca2+信號(hào)通路[15]。Wnt信號(hào)通路與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。在臨床報(bào)道中[16]，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路受體低密度受體脂蛋白相關(guān)蛋白6（LRP6）基因突變患者伴隨動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)更高，而LDLR-/-小鼠模型已經(jīng)成為研究動(dòng)脈粥樣硬化的模式動(dòng)物。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路配體Wnt 5α[17]，下游蛋白β-caternin[18]及其通路抑制劑DKK-1[19]均參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和動(dòng)脈粥樣斑塊的維持。因此Wnt/LRP6/β-catenin信號(hào)通路活性的改變已經(jīng)成為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的一大原因。而有報(bào)道顯示，非經(jīng)典Wnt/PCP信號(hào)通路同樣也與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)，其下游RoA/ROCK也參與動(dòng)脈粥樣硬化早期的內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷和后期的斑塊形成和破裂[20]。DVL作為Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，同時(shí)參與多條Wnt信號(hào)通路，是一個(gè)關(guān)鍵的樞紐分子[1]。在不同的Wnt信號(hào)通路中分別與不同的蛋白相互作用調(diào)控不同細(xì)胞活動(dòng)。盡管Wnt信號(hào)通路與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可[21-22]，然而，有關(guān)DVL在動(dòng)脈粥樣硬化過程中的作用機(jī)制還清楚，只有少量研究顯示DKK通過激活DVL1參與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移[23-24]，也有研究猜測DVL可能通過Wnt/PCP信號(hào)通路改變血管內(nèi)皮細(xì)胞的平面極性[25]。然而，DVL在動(dòng)脈粥樣硬化過程中通過與哪一些蛋白質(zhì)結(jié)合，以及通過哪一條Wnt信號(hào)通路調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能，并進(jìn)一步參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生還不清楚。此外，相比DVL1和DVL3，DVL2的功能研究還較為缺乏，因此，成功構(gòu)建DVL2干擾和過表達(dá)載體對(duì)于深入研究DVL2在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過程中的作用及其所涉及的Wnt通路蛋白具有重要的意義。