徐艷梅，裴麗娟，杜高鋒，宋更申

(1.河北省藥品檢驗研究院，石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院藥劑科， 石家莊 050031)

依度沙班(edoxyaban)是一種新型Xa因子抑制藥[1-2]，具有起效快、抗凝效果可逆、具有劑量依賴的效果等特點。2015年以來，美國食品藥品管理局(FDA)、歐洲藥品管理局(EMA)和瑞士藥品管理局相繼批準依度沙班用于非瓣膜性心房顫動患者腦卒中及系統(tǒng)性栓塞、急性靜脈栓塞患者深靜脈血栓和肺栓塞的預防及治療[3]。依度沙班原料藥在合成工藝中有一步甲磺酰化的過程，其中甲磺酰氯易與醇類反應產(chǎn)生甲磺酸酯[4]。依度沙班合成工藝中將甲醇和乙醇作為反應溶劑，因此依度沙班原料藥中可能存在甲磺酸甲酯(methyl methanesulfonate)、甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate)及甲磺酸異丙酯(isopropylmethanesulfonate)3種雜質(zhì)。甲磺酸酯類物質(zhì)是一種潛在性基因毒性雜質(zhì)[5-6]，這些雜質(zhì)的DNA烷基化作用會產(chǎn)生誘變效應、致癌效應和致畸效應[7]，嚴重威脅人類健康，因此需要嚴格控制藥品中甲磺酸酯的限度。根據(jù)EMEA發(fā)布的《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導原則》相關規(guī)定，按照毒理學擔憂閾值(TTC)作為評價大部分遺傳毒性雜質(zhì)的閾值，則遺傳毒性雜質(zhì)攝入量最大限值為1.5 μg·d-1[8-9]。依度沙班作為抗凝藥物使用時，每日通常使用劑量為30 mg，按此計算含甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯不得過50 μg·g-1。近年來，氣相色譜(GC)法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法和衍生化-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-GC-MS)法已被廣泛應用于甲磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)檢測[10-11]。筆者參考《歐洲藥典》(EP)8.0 版中關于甲磺酸鹽中甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯的測定方法，采用HS-GC-MS法對甲磺酸依度沙班原料藥中上述3 種遺傳毒性雜質(zhì)進行測定。

1 儀器與試藥

1.1儀器 GC-MS 2010 Plus色譜儀(日本Shimadzu公司)；DU305型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 依度沙班原料藥(河北志恒醫(yī)藥科技有限公司，批號：160031，160032，160033)；甲磺酸甲酯對照品(JSK SCIENTIFIC LTD，批號：LU80L27)；甲磺酸乙酯對照品(Atta Aesar，批號：10169291)；甲磺酸異丙酯對照品(ACROS，批號：A0314222)；甲磺酸丁酯(南京強山化工有限公司，批號：20130027)；乙腈和水均為色譜純，無水碘化鈉和硫代硫酸鈉均為分析純。

2 方法與結果

2.1GC-MS條件 色譜柱為DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；檢測器為MS檢測器；進樣口溫度為110 ℃；采用程序升溫，起始溫度為40 ℃，維持3 min，以20 ℃·min-1的速率升溫至150 ℃，維持2 min，然后以20 ℃·min-1的速率升溫至230 ℃，維持10 min；進樣方式為分流進樣，分流比20：1；載氣為高純氦氣；柱流量為0.6 mL·min-1；頂空進樣，爐溫60 ℃；平衡時間30 min；進樣體積1 mL，進樣時間1 min；離子源溫度200 ℃；接口溫度150 ℃；掃描方式為選擇離子掃描(SIM)；電子能量為70 eV。各待測成分的定性、定量信息見表1，質(zhì)譜圖見圖1。

表1待測成分的定性、定量信息

Tab.1Qualitativeandquantativedataoftheingredientundertest

2.2溶液配制

2.2.1衍生化試劑 精密稱取無水碘化鈉60.0 g和硫代硫酸鈉30 mg置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1碘代甲烷、碘代乙烷、碘代異丙烷和碘代丁烷的質(zhì)譜圖

Fig.1Massspetrumofmethyliodide,ethyliodide,iso-propyliodideandiodo-2-methylpropane

2.2.2內(nèi)標溶液 精密稱取甲磺酸丁酯25 mg，置25 mL量瓶中，加稀釋液(水-乙腈20：80)溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液50 μL，置于10 mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，另精密量取該溶液2 mL，至50 mL量瓶中，加稀釋液稀釋并定容至刻度，搖勻，作為內(nèi)標溶液。

2.2.3空白溶液 精密量取水-乙腈(20：80)0.5 mL與內(nèi)標溶液0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，立即密封，搖勻，作為空白溶液。

2.2.4對照品溶液 精密稱取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯各約50 mg，分別加甲苯溶解并稀釋至10 mL，搖勻；精密量取50 μL，置同一25 mL量瓶中，加內(nèi)標溶液稀釋并定容，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液150 μL，置10 mL量瓶中，加內(nèi)標溶液稀釋定容，即得。分別精密量取該溶液0.5 mL及衍生化試劑0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，立即密封，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.5供試品溶液 精密稱取樣品30 mg，置20 mL頂空瓶中，加0.5 mL內(nèi)標溶液及0.5 mL衍生化試劑，立即壓蓋密封，超聲溶解，作為供試品溶液。

2.3專屬性考察 取空白溶液、甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯對照品溶液和供試品溶液各1 mL，按“2.1”項色譜條件，記錄色譜圖。內(nèi)標衍生物碘代丁烷保留時間為5.52 min，甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯的衍生物碘代甲烷、碘代乙烷和碘代異丙烷的保留時間分別為2.87，3.52，3.81 min，各峰之間的分離度均>2.0，符合檢測要求。

2.4檢測限和定量限考察 取對照品溶液，加內(nèi)標液逐級稀釋成不同質(zhì)量濃度，分別精密量取該溶液0.5 mL及衍生化試劑0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，搖勻，立即密封。按“2.1”項色譜條件分別進樣，測定各雜質(zhì)的檢測限(S/N=3)和定量限(S/N=10)。結果，甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯檢測限分別為5，5和10 ng·mL-1，定量限為15，15和30 ng·mL-1。

2.5線性關系考察 精密量取對照品貯備溶液0.05，0.1，0.5，1.0，3.0 mL，置10 mL量瓶中，加內(nèi)標溶液稀釋定容，制得3種成分濃度分別約0.05，0.1，0.5，1.0，3.0 μg·mL-1，分別精密量取該溶液0.5 mL及衍生化試劑0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，立即密封，搖勻，作為線性工作溶液。按“2.1”項下色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。以對照品溶液的質(zhì)量分數(shù)為橫坐標，主成分與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標，繪制標準曲線，3種雜質(zhì)的線性結果見表2。實驗結果表明，甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯均在0.05～3.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

表23種成分的線性結果

Tab.2Linearityofthreekindsofcomponents

成分線性方程r線性范圍/(μg·mL-1)甲磺酸甲酯Y=18 763.82X-156.580.998 50.05～3.0甲磺酸乙酯Y=15 074.22X-112.760.999 00.05～3.0甲磺酸異丙酯Y=10 859.26X-48.630.998 90.05～3.0

2.6精密度實驗 取“2.5”項下線性工作溶液(3)，按“2.1”項色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。經(jīng)計算得A甲磺酸甲酯/A內(nèi)標、A甲磺酸乙酯/A內(nèi)標和A甲磺酸異丙酯/A內(nèi)標的RSD分別為2.4%，3.0%，2.9%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.7重復性實驗 精密稱取樣品(批號：160031)30 mg，置20 mL頂空瓶中，加入0.15 μg·mL-1標準溶液0.5 mL及衍生化試劑0.5 mL，立即壓蓋密封，超聲溶解，按“2.1”項色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。測定加標樣品中甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯的含量，平行測定6次。結果表明該方法重復性良好，滿足測定要求。

2.8加樣回收率實驗 精密稱取樣品(批號：160031)30 mg，共9份，分別置于20 mL頂空瓶中，精密加入對照品貯備溶液(10 μg·mL-1)2.25， 1.50和0.75 mL，每種濃度平行制備3份進行測定，分別加入衍生化試劑0.5 mL，立即壓蓋密封，超聲溶解，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。根據(jù)內(nèi)標法計算甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯的平均回收率(n=9)分別為96.4%，96.1%和96.5%。結果見表3。

2.9樣品含量測定 按“2.1”項色譜條件和“2.2”項對照品溶液和供試品溶液的制備方法操作，測定3批原料藥中3種遺傳毒性物質(zhì)，以內(nèi)標法計算甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯的含量，測定結果見表4。

表33種成分的回收率結果

Tab.3Recoveryresultsofthreekindsofcomponents

成分取樣量/mg原有量加入量測得量μg加樣回收率/%甲磺酸甲酯30.000.004 52.252.2198.0230.000.004 52.252.2097.5830.000.004 52.252.2198.0230.000.004 51.501.4797.7030.000.004 51.501.4697.0330.000.004 51.501.4697.0330.000.004 50.750.7295.4030.000.004 50.750.7092.7330.000.004 50.750.7194.07甲磺酸乙酯30.000.005 72.252.2097.5230.000.005 72.252.1997.0830.000.005 72.252.2197.9730.000.005 71.501.4596.2930.000.005 71.501.4495.6230.000.005 71.501.4696.9530.000.005 70.750.7396.5730.000.005 70.750.7092.5730.000.005 70.750.7193.91甲磺酸異丙酯30.000.000 02.252.1997.3330.000.000 02.252.2298.6730.000.000 02.252.2198.2230.000.000 01.501.4697.3330.000.000 01.501.4596.6730.000.000 01.501.4395.3330.000.000 00.750.7397.3330.000.000 00.750.7093.3330.000.000 00.750.7194.67

表4樣品中3種遺傳毒性物質(zhì)含量測定結果

Tab.4Contentdeterminationonthreekindsofgenotoxicimpuritiesinsamplesμg·g-1

批號甲磺酸甲酯甲磺酸乙酯甲磺酸異丙酯1600310.150.190.001600320.110.170.001600330.090.160.00

3 討論

本研究采用內(nèi)標法進行定量分析，選取待測物的同系物甲磺酸丁酯作為內(nèi)標物，其衍生化產(chǎn)物為碘代丁烷，與待測物質(zhì)完全分離，且靈敏度較高。因此，甲磺酸丁酯可作為這3種遺傳毒性雜質(zhì)含量測定的內(nèi)標物。

因本品理化性質(zhì)原因，溶解性較差，在溶劑篩選過程中分別考察了甲醇、異丙醇、二氯甲烷和乙腈等溶劑。實驗結果表明，選用混合溶劑水-乙腈(20：80)效果最佳。

實驗中考察了不同極性的色譜柱，結果表明，3種待測組分和內(nèi)標物在DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)上的峰形和分離度最佳。

實驗采用DB-WAX毛細管柱內(nèi)徑為0.25 mm，采用常用流速1.0 mL·min-1不能使3種待測組分和內(nèi)標物達到分離度的要求，故考察了1.0，0.8和0.6 mL·min-13種不同流速對分離度的影響，結果表明，流速為0.6 mL·min-1時，分離效果最好。

色譜分離時，不僅載氣流速影響分離度，而且升溫程序的不同也會導致色譜峰分離度的變化。由于3種待測組分和內(nèi)標物的沸點接近，為了使之達到很好的分離，需采用較低的起始溫度進行實驗，最終選擇40 ℃作為起始溫度，程序升溫進行實驗。

頂空條件的優(yōu)化主要考察了兩個方面，包括爐溫和平衡時間的選擇。實驗考察了不同爐溫對實驗結果的影響，結果表明，爐溫為60 ℃時，能夠使3種待測組分和內(nèi)標物充分氣化。不僅爐溫會影響氣化程度，平衡時間也會影響氣化程度，不同的平衡時間直接影響頂空進樣的濃度，故考察了平衡時間的影響，最終選擇平衡時間為30 min。

本研究采用HS-GC-MS方法對依度沙班合成過程中可能產(chǎn)生的基因毒性物質(zhì)甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯進行含量測定，對于確保臨床用藥的安全性和有效性具有重要的意義。