張江寧,楊春,張玲,丁衛(wèi)英

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,太原 030031)

紅曲在中國已有上千年的歷史，紅曲霉發(fā)酵物紅曲在食品著色、食品防腐及藥用醫(yī)療等方面的應(yīng)用都有記載[1]，國內(nèi)外大量研究表明紅曲含有洛伐他汀成分，因此具有明顯的降膽固醇和降血脂的功效[2]。食醋是重要的調(diào)味品之一,目前市售紅曲醋經(jīng)動物實驗證明其降血脂作用并不明顯，主要原因是其功效成分含量較低，同時紅曲霉發(fā)酵過程中產(chǎn)生對人體有害的真菌毒素桔青霉素，因此，如何通過工藝革新提高紅曲醋中洛伐他汀含量、降低桔青霉素含量具有重要意義。

本實驗采用純種培養(yǎng)專用紅曲霉與老陳醋生產(chǎn)工藝相結(jié)合生產(chǎn)紅曲保健陳醋，研究紅曲醋制備過程中酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵階段，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、翻曲次數(shù)對洛伐他丁、桔青霉素含量的影響，旨在掌握生產(chǎn)主動權(quán)，充分提高功能成分含量，適應(yīng)現(xiàn)代化生產(chǎn)，豐富功能性醋的產(chǎn)品種類，提高老陳醋的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲米(實驗室自制)、酵母菌、醋酸菌、糖化酶、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(7∶3∶1)。高效液相色譜儀：DIONEX UltiMate 3000 配備泵RS Pump，自動進樣器RS Autosampler，柱溫箱RS Column Compartment。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 洛伐他汀UHPLC測定方法[3-6]

1.2.2.1 發(fā)酵樣品處理

發(fā)酵樣品碾磨烘干過40目篩，取0.5 g于50 mL比色管中，用70%乙醇溶液定容到50 mL,55 ℃水浴萃取1 h ,每隔20 min震蕩1次，水浴結(jié)束后冷卻至室溫，取5 mL萃取液微濾。

1.2.2.2 UHPLC條件

色譜柱名稱：Thermo Scientific Hypersil GOLD (100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)，流動相A為純水，流動相B為乙腈，流速0.200 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長238 nm，進樣量2 μL。

1.2.3 桔青霉素含量測定方法[7,8]

1.2.3.1 發(fā)酵樣品處理

將固態(tài)紅曲樣品置100 mL具塞比色管中，用60 mL TEF溶液超聲提取5 min(強度30%，工作10 s，間隔5 s)，于4000 r/min離心10 min，用40 mL TEF溶液同上述步驟再提取2次，合并3次提取上清液于250 mL具塞三角瓶中，50 ℃真空濃縮至干后加入70 mL甲醇溶解，經(jīng)微孔有機濾膜過濾后進行HPLC分析。

1.2.3.2 UHPLC檢測條件

色譜柱名稱：Thermo Scientific Hypersil GOLD，流速0.200 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長238 nm，進樣量2 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 酒精發(fā)酵階段落洛伐他汀、桔青霉素含量的變化

2.1.1 酒精發(fā)酵階段發(fā)酵溫度對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響

圖1 酒精發(fā)酵階段發(fā)酵溫度對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響

酒精發(fā)酵階段是將1%的酵母與一定量的紅曲米混合發(fā)酵，實際上是一個酵母與紅曲霉菌組成的共菌發(fā)酵過程，其中酵母的適宜發(fā)酵溫度為28～30 ℃，紅曲菌的適宜發(fā)酵溫度為28～34 ℃，因此應(yīng)當(dāng)確定共菌發(fā)酵的適宜發(fā)酵溫度。分別選擇28，30，32，34 ℃作為發(fā)酵溫度發(fā)酵9天，測定洛伐他汀、桔青霉素的含量變化，由圖1可知，酒精發(fā)酵階段溫度低于32 ℃時，隨著發(fā)酵溫度升高，洛伐他汀含量升高，之后下降，桔青霉素含量隨著發(fā)酵溫度升高而下降；當(dāng)溫度為32 ℃時，洛伐他汀含量最高，桔青霉素在一個較低的水平，因此選擇32 ℃進行酒精發(fā)酵。

2.1.2 酒精發(fā)酵階段接種量對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響

發(fā)酵過程中，接種量與菌體的生長繁殖速度、次級代謝產(chǎn)物的合成密切相關(guān)。本實驗在酒精發(fā)酵階段接入5%，10%，20%，30%，40%(V/W，W為固態(tài)基質(zhì)的質(zhì)量)紅曲米，研究其對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酒精發(fā)酵階段接種量對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響

隨著接種量的增加, 洛伐他汀、桔青霉素的含量均增加,當(dāng)接種量至20%時,趨于穩(wěn)定,之后雖然含量有所增加但變化不大,這說明接種量太低導(dǎo)致菌體在發(fā)酵過程中生長較慢,因此代謝物質(zhì)較少；而大的接種量有利于縮短菌體生長的調(diào)整期，使產(chǎn)物合成提前到來，但過大的接種量會使菌體生長過快，營養(yǎng)物質(zhì)迅速消耗用于菌體生長，不利于后期次級代謝產(chǎn)物的合成。因此確定接種量為20%時，產(chǎn)品中洛伐他汀含量達到最大。

2.1.3 酒精發(fā)酵階段發(fā)酵時間對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響

選擇32 ℃，紅曲米接種量為20%，分別選擇發(fā)酵時間為3，6，9，12，15天，測定洛伐他汀、桔青霉素含量及酒精度的變化，見圖3和表1。

圖3 酒精發(fā)酵階段發(fā)酵時間對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響

發(fā)酵時間(天)3691215酒精度(°)6.88.31010.19.9

由圖3可知，當(dāng)酒精發(fā)酵時間達到9天時，洛伐他汀的積累量基本達到最大值，之后隨著發(fā)酵時間延長，變化不顯著；隨著發(fā)酵時間延長，桔青霉素含量逐漸增大。同時發(fā)酵液中的酒精度隨著發(fā)酵時間的增加在不斷變化，發(fā)酵3～9天酒精度變化最明顯，從6.8°升至10°，之后在發(fā)酵后期酒精度逐漸降低，當(dāng)酒精度低于10°時，會影響后期醋酸發(fā)酵過程中醋酸的積累[9,10]，有害雜菌必然大量繁殖, 酵母早衰, 給中后期發(fā)酵帶來不利影響，因此酒精發(fā)酵時間確定為9天。

2.2 醋酸發(fā)酵階段洛伐他汀、桔青霉素含量的變化

2.2.1 醋酸發(fā)酵階段發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響

該醋酸發(fā)酵階段是將醋酸菌與一定量的紅曲霉菌混合發(fā)酵，其中醋酸發(fā)酵的醅子在3天內(nèi)爭取90%左右達到38 ℃，溫度過低，醋酸菌生長繁殖受到抑制，如果溫度過高, 在發(fā)酵過程中揮發(fā)損失酒精，影響產(chǎn)醋，而紅曲菌適宜發(fā)酵溫度為28～34 ℃，因此在發(fā)酵初期應(yīng)當(dāng)以醋酸菌發(fā)酵為主，將發(fā)酵條件控制在38 ℃，促進醋酸菌生長，當(dāng)酸度達到4%左右時，即根據(jù)表2應(yīng)發(fā)酵12天，之后將溫度降低至紅曲霉菌的適宜生長溫度32 ℃繼續(xù)發(fā)酵，以利于次級代謝產(chǎn)物積累[11]。由圖4可知，在前12天，洛伐他汀、桔青霉素含量有些許升高但變化不顯著，當(dāng)溫度降低后，發(fā)酵至18天時，洛伐他汀含量達到最高，之后趨于穩(wěn)定，桔青霉素在發(fā)酵第15天時，處于較低水平，之后含量急劇升高，說明發(fā)酵后期桔青霉素生成量不斷積累，呈現(xiàn)上升趨勢。因此為減少后期產(chǎn)品中桔青霉素含量，避開桔青霉素生長的高峰期，綜合考慮將發(fā)酵時間定為15天。綜上，醋酸發(fā)酵階段采取分段發(fā)酵法，先將物料在38 ℃下發(fā)酵12天，然后將溫度降低至32 ℃發(fā)酵3天左右。

表2 醋酸發(fā)酵階段發(fā)酵時間與酸度的關(guān)系

圖4 醋酸發(fā)酵階段發(fā)酵時間對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響

2.2.2 醋酸發(fā)酵階段翻醅次數(shù)對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響

圖5 醋酸發(fā)酵階段翻醅次數(shù)對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響

醋酸發(fā)酵過程中通過分層翻醅，使醅子內(nèi)的醋酸菌充分和氧氣接觸才能把酒精氧化成醋酸。翻曲次數(shù)分別為每天 1，2，3，4 次, 每個處理 3 個重復(fù),發(fā)酵終了測定洛伐他汀和桔青霉素的值。由圖5可知，隨著翻曲次數(shù)增加，洛伐他汀、桔青霉素含量降低，說明溶氧對紅曲發(fā)酵產(chǎn)桔青霉素與色素的影響較大，因此翻曲次數(shù)為每天 1次。

3 小結(jié)

酒精發(fā)酵階段溫度低于32 ℃時，隨著發(fā)酵溫度升高洛伐他汀含量升高，之后下降，桔青霉素含量隨著發(fā)酵溫度升高而下降；隨著接種量增加, 洛伐他汀、桔青霉素含量均增加,當(dāng)接種量至20%時,趨于穩(wěn)定,之后雖然含量有所增加但變化不大；當(dāng)酒精發(fā)酵時間達到9天時，洛伐他汀的積累量基本達到最大值，之后隨著發(fā)酵時間延長，變化不顯著；桔青霉素含量隨著發(fā)酵時間延長，逐漸增大；醋酸發(fā)酵階段隨著翻曲次數(shù)增加，洛伐他汀、桔青霉素含量降低。

酒精發(fā)酵階段工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度32 ℃，酵母菌接種量為20%，發(fā)酵時間為9天，發(fā)酵結(jié)束時酒精度為10°；醋酸發(fā)酵階段分段發(fā)酵法，即38 ℃下發(fā)酵12天，然后將溫度降低至32 ℃發(fā)酵3天左右，翻曲次數(shù)為每天 1次。該工藝制得的醋洛伐他汀含量為0.05 mg/mL，桔青霉素含量為0.01 mg/L。