倪玉佳，戈 煜，湯 露，瞿發(fā)林

0 引言

復(fù)方烏參膠囊、夜寧膠囊、復(fù)方銀杏葉膠囊、復(fù)方珍珠粉膠囊、黃元膠囊、郁福來膠囊均為解放軍第102醫(yī)院非標(biāo)準(zhǔn)制劑，在臨床應(yīng)用廣泛。該6種制劑為不同類型的膠囊劑，其中夜寧膠囊、復(fù)方銀杏葉膠囊、郁福來膠囊為全浸膏制劑；復(fù)方烏參膠囊、復(fù)方珍珠粉膠囊、黃元膠囊為非無菌含藥材原粉的制劑；同時，黃元膠囊和郁福來膠囊含有較強的抑菌成分。對以上不同類型的膠囊劑若不經(jīng)過微生物限度檢查方法驗證，而都采用常規(guī)法進行試驗，有可能造成制劑中被污染微生物漏檢的情況[1-3]?！吨袊幍洹?015年版與2010年版比較，在微生物限度檢查法方面有巨大變化，如試驗所用菌株、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時間等[2-4]。因此，本文參照文獻[2]對6種膠囊劑重新進行微生物限度檢查方法驗證，以確保藥品中污染的微生物能被真實檢出，為制劑的質(zhì)量穩(wěn)定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 電子天平(型號：FA1104N，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；潔凈工作臺(型號：SM-CJ-1FD，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(型號：ZHS-150SC，上海喆圖科學(xué)儀器公司)；霉菌培養(yǎng)箱(型號：MJ-160，上海躍進醫(yī)療器械廠)；立式壓力蒸汽滅菌器(型號：LDZX-30KBS，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 藥品 A：復(fù)方烏參膠囊(規(guī)格：0.4 g；批號：20150713、20160104、20160428)；B：黃元膠囊(規(guī)格：0.5 g；批號：20161103、20170420、20170512)；C：復(fù)方珍珠粉膠囊(規(guī)格：0.2 g；批號：20160325、20161117、20170421)；D：夜寧膠囊(規(guī)格：0.4 g；批號：20161130、20170309、20170522)；E：復(fù)方銀杏葉膠囊(規(guī)格：0.2 g；批號：20160223、20160628、20170410)；F：郁福來膠囊(規(guī)格：0.3 g；批號：20161129、20170401、20170512)。以上制劑皆為我院自制。

1.3 菌株 枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]及銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]均為3代斜面，由江蘇省食品藥品檢驗所提供；大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]及黑曲霉[CMCC(F)98003]均為0代凍干粉，由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.4 稀釋液及培養(yǎng)基 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：160801)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，批號：1609262)、胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基(TSB，批號：160802)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA，批號：161017)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號：151109)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號：151022)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基(批號：151104)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：1511102)、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基(批號：1602192)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(批號：1601043)、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基(批號：160121)均購于北京三藥科技開發(fā)公司。0.9%無菌氯化鈉溶液由四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司提供。

2 方法[2]

2.1 菌液的制備 根據(jù)《中國藥典》(2015年版)要求制備，分別制成合適濃度的菌懸液。

2.2 供試液的制備 供試品選取10 g后，加入稀釋液pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，至刻度100 ml，在水浴中振蕩(45 ℃)，混勻，得1∶10的供試液。以10倍稀釋制成1∶100的供試液，用作復(fù)方烏參膠囊(A)、復(fù)方珍珠粉膠囊(C)、夜寧膠囊(D)、復(fù)方銀杏葉膠囊(E)的需氧菌總數(shù)檢查用。以10倍逐級稀釋制成1∶1 000的供試液作黃元膠囊(B)的需氧菌總數(shù)檢查用。

以上述同法制成1∶10的供試液，作復(fù)方烏參膠囊(A)、黃元膠囊(B)、復(fù)方珍珠粉膠囊(C)、夜寧膠囊(D)及復(fù)方銀杏葉膠囊(E)的霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌檢查用。

因郁福來膠囊(F)為腸溶膠囊，以pH 6.8無菌磷酸鹽緩沖液為稀釋液，制成1∶1 000的供試液作需氧菌總數(shù)檢查用；1∶10的供試液作霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌檢查用。

2.3 微生物計數(shù)檢查方法的建立及驗證

2.3.1 試驗組 需氧菌總數(shù)：各取“2.2”項下制備好已稀釋的1∶100供試液100 ml，與相應(yīng)試驗菌1 ml(使其最終菌濃度≤100 cfu/ml)于無菌錐形瓶中混勻。從錐形瓶中吸取膠囊A、B、C、D、E 1 ml注皿，以胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)澆碟，33 ℃培養(yǎng)3 d，每組兩平行，以平均數(shù)作為結(jié)果。膠囊F采用薄膜過濾法，取1∶1 000的供試液1 ml過膜，以1 000 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分10次沖洗，濾膜貼于TSA培養(yǎng)，計數(shù)。

霉菌和酵母菌總數(shù)：各膠囊分別取“2.2”項下制備好已稀釋的1∶10供試液100 ml，與相應(yīng)試驗菌1 ml(使其最終菌濃度≤100 cfu/ml)，于無菌錐形瓶中混勻后，取1 ml注皿，以沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)澆碟，23 ℃培養(yǎng)5 d，每組兩平行，以平均數(shù)作為結(jié)果。

2.3.2 供試品對照組 取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液，操作同試驗組。測定供試品的本底菌數(shù)。

2.3.3 菌液對照組 以稀釋液代替供試液操作同試驗組。測定菌液對照組的菌落數(shù)。

2.3.4 回收率計算 分別計算各試驗菌的回收率，結(jié)果見表1、表2。回收率R為0.5～2，則此驗證方法可行。

2.4 控制菌檢查方法的驗證 因復(fù)方烏參膠囊(A)、黃元膠囊(B)及復(fù)方珍珠粉膠囊(C)為口服固體給藥制劑，且有原藥材入藥，故應(yīng)對耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌及乙型副傷寒沙門菌進行控制菌驗證試驗。其他膠囊只進行大腸埃希菌控制菌試驗。

其中，所有膠囊采用常規(guī)法檢查大腸埃希菌；復(fù)方烏參膠囊(A)、黃元膠囊(B)及復(fù)方珍珠粉膠囊(C)采用常規(guī)法檢查耐膽鹽革蘭陰性菌，采用培養(yǎng)基稀釋法(200 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基)檢查乙型副傷寒沙門菌。要求試驗組均可檢出，供試品對照組、陰性對照組未檢出，詳細結(jié)果見表3。

表1 各膠囊需氧菌總數(shù)驗證結(jié)果

表2 各膠囊霉菌和酵母菌總數(shù)試驗結(jié)果

表3 控制菌檢查驗證結(jié)果

2.5 樣品檢驗 各取3批樣品，按上述微生物計數(shù)及控制菌檢查方法檢驗，結(jié)果見表4。

3 討論

根據(jù)上述微生物限度檢查方法驗證可知，全浸膏制劑(夜寧膠囊、復(fù)方銀杏葉膠囊)及非無菌含藥材原粉制劑(復(fù)方烏參膠囊和復(fù)方珍珠粉膠囊)抑菌效果一般，采用平皿法(需氧菌總數(shù)為1∶100的供試液、霉菌酵母菌總數(shù)為1∶10的供試液)，各試驗菌株回收率即可達到0.5～2，滿足試驗要求。黃元膠囊為大黃、玄明粉粉碎混合制成，其中大黃含有抑菌成分[5-7]，故需采用較高稀釋級供試液(需氧菌總數(shù)為1∶1 000的供試液)才能滿足回收率要求。而郁福來膠囊主要成分為貫葉金絲桃提取物，內(nèi)含金絲桃素，其對革蘭陽性及部分革蘭陰性菌有抑制作用[8]。由于《中國藥典》2015年版刪除了離心法，且無合適的中和劑，故選擇1∶1 000的供試品稀釋級進行薄膜過濾法試驗。

中藥膠囊劑微生物限度方法驗證常會遇到膠囊殼不易溶解的情況，采用水浴法，將各膠囊置于45 ℃水浴溫度下并加以震蕩，能較好地解決這個問題[9-11]，同時不會影響膠囊內(nèi)容物中原有微生物的檢出。因中藥膠囊中有一些藥物顆粒不溶于稀釋劑中，當(dāng)采用平皿法進行中藥膠囊驗證時，遇到不溶顆粒與菌落不可區(qū)分的情況，可借助放大鏡等工具或者采用加入染色劑的方法[12]，避免計數(shù)誤差的狀況出現(xiàn)。當(dāng)采用薄膜過濾法試驗時，由于藥粉顆粒較大不易過膜，需加大供試品的稀釋級或采用脫脂棉等手段進行濾液處理后試驗[13]。

表4 不同批次樣品檢驗結(jié)果

試驗中所用菌種為活性生物，接種量、生長溫度、培養(yǎng)時間、活化代數(shù)、個人操作等因素皆會影響菌懸液的濃度，本試驗摸索各菌種稀釋級如下：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及乙型副傷寒沙門菌為1×10-7；金黃色葡萄球菌為7×10-6；枯草芽孢桿菌為1×10-6；白色念珠菌為5×10-4，可供同行實驗人員參考。

《中國藥典》2015年版雖未規(guī)定微生物限度驗證的批次，但本試驗中發(fā)現(xiàn)，個別中藥膠囊會出現(xiàn)同品種不同批號的制劑回收率不同的問題，排除人為操作及培養(yǎng)環(huán)境的影響，考慮到不同產(chǎn)地、不同季節(jié)采摘、儲存條件不一致會造成中藥材成分不均一的情況[14-16]，故需進行至少3批供試品驗證為宜，以保證結(jié)果的可靠性。

本研究建立了適合于夜寧膠囊、復(fù)方銀杏葉膠囊、復(fù)方烏參膠囊、復(fù)方珍珠粉膠囊、黃元膠囊及郁福來膠囊6種不同類型中藥膠囊制劑的微生物限度檢查方法，基本涵蓋了中藥口服膠囊劑的劑型，為制劑的質(zhì)量穩(wěn)定提供了可靠的保證。