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        六種中藥膠囊劑微生物限度檢查方法驗證

        2019-01-15 05:31:24倪玉佳瞿發(fā)林
        實用藥物與臨床 2018年11期
        關(guān)鍵詞:試液制劑批號

        倪玉佳,戈 煜,湯 露,瞿發(fā)林

        0 引言

        復方烏參膠囊、夜寧膠囊、復方銀杏葉膠囊、復方珍珠粉膠囊、黃元膠囊、郁福來膠囊均為解放軍第102醫(yī)院非標準制劑,在臨床應(yīng)用廣泛。該6種制劑為不同類型的膠囊劑,其中夜寧膠囊、復方銀杏葉膠囊、郁福來膠囊為全浸膏制劑;復方烏參膠囊、復方珍珠粉膠囊、黃元膠囊為非無菌含藥材原粉的制劑;同時,黃元膠囊和郁福來膠囊含有較強的抑菌成分。對以上不同類型的膠囊劑若不經(jīng)過微生物限度檢查方法驗證,而都采用常規(guī)法進行試驗,有可能造成制劑中被污染微生物漏檢的情況[1-3]?!吨袊幍洹?015年版與2010年版比較,在微生物限度檢查法方面有巨大變化,如試驗所用菌株、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時間等[2-4]。因此,本文參照文獻[2]對6種膠囊劑重新進行微生物限度檢查方法驗證,以確保藥品中污染的微生物能被真實檢出,為制劑的質(zhì)量穩(wěn)定提供科學依據(jù)。

        1 材料

        1.1 儀器 電子天平(型號:FA1104N,上海精密科學儀器有限公司);潔凈工作臺(型號:SM-CJ-1FD,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);恒溫恒濕培養(yǎng)箱(型號:ZHS-150SC,上海喆圖科學儀器公司);霉菌培養(yǎng)箱(型號:MJ-160,上海躍進醫(yī)療器械廠);立式壓力蒸汽滅菌器(型號:LDZX-30KBS,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

        1.2 藥品 A:復方烏參膠囊(規(guī)格:0.4 g;批號:20150713、20160104、20160428);B:黃元膠囊(規(guī)格:0.5 g;批號:20161103、20170420、20170512);C:復方珍珠粉膠囊(規(guī)格:0.2 g;批號:20160325、20161117、20170421);D:夜寧膠囊(規(guī)格:0.4 g;批號:20161130、20170309、20170522);E:復方銀杏葉膠囊(規(guī)格:0.2 g;批號:20160223、20160628、20170410);F:郁福來膠囊(規(guī)格:0.3 g;批號:20161129、20170401、20170512)。以上制劑皆為我院自制。

        1.3 菌株 枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]及銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]均為3代斜面,由江蘇省食品藥品檢驗所提供;大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]及黑曲霉[CMCC(F)98003]均為0代凍干粉,由中國食品藥品檢定研究院提供。

        1.4 稀釋液及培養(yǎng)基 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號:160801)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA,批號:1609262)、胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基(TSB,批號:160802)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA,批號:161017)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號:151109)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號:151022)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基(批號:151104)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號:1511102)、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基(批號:1602192)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(批號:1601043)、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基(批號:160121)均購于北京三藥科技開發(fā)公司。0.9%無菌氯化鈉溶液由四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司提供。

        2 方法[2]

        2.1 菌液的制備 根據(jù)《中國藥典》(2015年版)要求制備,分別制成合適濃度的菌懸液。

        2.2 供試液的制備 供試品選取10 g后,加入稀釋液pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,至刻度100 ml,在水浴中振蕩(45 ℃),混勻,得1∶10的供試液。以10倍稀釋制成1∶100的供試液,用作復方烏參膠囊(A)、復方珍珠粉膠囊(C)、夜寧膠囊(D)、復方銀杏葉膠囊(E)的需氧菌總數(shù)檢查用。以10倍逐級稀釋制成1∶1 000的供試液作黃元膠囊(B)的需氧菌總數(shù)檢查用。

        以上述同法制成1∶10的供試液,作復方烏參膠囊(A)、黃元膠囊(B)、復方珍珠粉膠囊(C)、夜寧膠囊(D)及復方銀杏葉膠囊(E)的霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌檢查用。

        因郁福來膠囊(F)為腸溶膠囊,以pH 6.8無菌磷酸鹽緩沖液為稀釋液,制成1∶1 000的供試液作需氧菌總數(shù)檢查用;1∶10的供試液作霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌檢查用。

        2.3 微生物計數(shù)檢查方法的建立及驗證

        2.3.1 試驗組 需氧菌總數(shù):各取“2.2”項下制備好已稀釋的1∶100供試液100 ml,與相應(yīng)試驗菌1 ml(使其最終菌濃度≤100 cfu/ml)于無菌錐形瓶中混勻。從錐形瓶中吸取膠囊A、B、C、D、E 1 ml注皿,以胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)澆碟,33 ℃培養(yǎng)3 d,每組兩平行,以平均數(shù)作為結(jié)果。膠囊F采用薄膜過濾法,取1∶1 000的供試液1 ml過膜,以1 000 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分10次沖洗,濾膜貼于TSA培養(yǎng),計數(shù)。

        霉菌和酵母菌總數(shù):各膠囊分別取“2.2”項下制備好已稀釋的1∶10供試液100 ml,與相應(yīng)試驗菌1 ml(使其最終菌濃度≤100 cfu/ml),于無菌錐形瓶中混勻后,取1 ml注皿,以沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)澆碟,23 ℃培養(yǎng)5 d,每組兩平行,以平均數(shù)作為結(jié)果。

        2.3.2 供試品對照組 取制備好的供試液,以稀釋液代替菌液,操作同試驗組。測定供試品的本底菌數(shù)。

        2.3.3 菌液對照組 以稀釋液代替供試液操作同試驗組。測定菌液對照組的菌落數(shù)。

        2.3.4 回收率計算 分別計算各試驗菌的回收率,結(jié)果見表1、表2?;厥章蔙為0.5~2,則此驗證方法可行。

        2.4 控制菌檢查方法的驗證 因復方烏參膠囊(A)、黃元膠囊(B)及復方珍珠粉膠囊(C)為口服固體給藥制劑,且有原藥材入藥,故應(yīng)對耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌及乙型副傷寒沙門菌進行控制菌驗證試驗。其他膠囊只進行大腸埃希菌控制菌試驗。

        其中,所有膠囊采用常規(guī)法檢查大腸埃希菌;復方烏參膠囊(A)、黃元膠囊(B)及復方珍珠粉膠囊(C)采用常規(guī)法檢查耐膽鹽革蘭陰性菌,采用培養(yǎng)基稀釋法(200 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基)檢查乙型副傷寒沙門菌。要求試驗組均可檢出,供試品對照組、陰性對照組未檢出,詳細結(jié)果見表3。

        表1 各膠囊需氧菌總數(shù)驗證結(jié)果

        表2 各膠囊霉菌和酵母菌總數(shù)試驗結(jié)果

        表3 控制菌檢查驗證結(jié)果

        2.5 樣品檢驗 各取3批樣品,按上述微生物計數(shù)及控制菌檢查方法檢驗,結(jié)果見表4。

        3 討論

        根據(jù)上述微生物限度檢查方法驗證可知,全浸膏制劑(夜寧膠囊、復方銀杏葉膠囊)及非無菌含藥材原粉制劑(復方烏參膠囊和復方珍珠粉膠囊)抑菌效果一般,采用平皿法(需氧菌總數(shù)為1∶100的供試液、霉菌酵母菌總數(shù)為1∶10的供試液),各試驗菌株回收率即可達到0.5~2,滿足試驗要求。黃元膠囊為大黃、玄明粉粉碎混合制成,其中大黃含有抑菌成分[5-7],故需采用較高稀釋級供試液(需氧菌總數(shù)為1∶1 000的供試液)才能滿足回收率要求。而郁福來膠囊主要成分為貫葉金絲桃提取物,內(nèi)含金絲桃素,其對革蘭陽性及部分革蘭陰性菌有抑制作用[8]。由于《中國藥典》2015年版刪除了離心法,且無合適的中和劑,故選擇1∶1 000的供試品稀釋級進行薄膜過濾法試驗。

        中藥膠囊劑微生物限度方法驗證常會遇到膠囊殼不易溶解的情況,采用水浴法,將各膠囊置于45 ℃水浴溫度下并加以震蕩,能較好地解決這個問題[9-11],同時不會影響膠囊內(nèi)容物中原有微生物的檢出。因中藥膠囊中有一些藥物顆粒不溶于稀釋劑中,當采用平皿法進行中藥膠囊驗證時,遇到不溶顆粒與菌落不可區(qū)分的情況,可借助放大鏡等工具或者采用加入染色劑的方法[12],避免計數(shù)誤差的狀況出現(xiàn)。當采用薄膜過濾法試驗時,由于藥粉顆粒較大不易過膜,需加大供試品的稀釋級或采用脫脂棉等手段進行濾液處理后試驗[13]。

        表4 不同批次樣品檢驗結(jié)果

        試驗中所用菌種為活性生物,接種量、生長溫度、培養(yǎng)時間、活化代數(shù)、個人操作等因素皆會影響菌懸液的濃度,本試驗摸索各菌種稀釋級如下:大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及乙型副傷寒沙門菌為1×10-7;金黃色葡萄球菌為7×10-6;枯草芽孢桿菌為1×10-6;白色念珠菌為5×10-4,可供同行實驗人員參考。

        《中國藥典》2015年版雖未規(guī)定微生物限度驗證的批次,但本試驗中發(fā)現(xiàn),個別中藥膠囊會出現(xiàn)同品種不同批號的制劑回收率不同的問題,排除人為操作及培養(yǎng)環(huán)境的影響,考慮到不同產(chǎn)地、不同季節(jié)采摘、儲存條件不一致會造成中藥材成分不均一的情況[14-16],故需進行至少3批供試品驗證為宜,以保證結(jié)果的可靠性。

        本研究建立了適合于夜寧膠囊、復方銀杏葉膠囊、復方烏參膠囊、復方珍珠粉膠囊、黃元膠囊及郁福來膠囊6種不同類型中藥膠囊制劑的微生物限度檢查方法,基本涵蓋了中藥口服膠囊劑的劑型,為制劑的質(zhì)量穩(wěn)定提供了可靠的保證。

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