任志敏，忻勝兵，徐娜，薛惠君，陳忠軍*

1(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018) 2(北京師范大學(xué) 附屬實(shí)驗(yàn)中學(xué)，北京，100032)

Cheddar干酪起源于16世紀(jì)的英國切達(dá)郡，是一種硬質(zhì)全脂干酪，其色澤乳白或淺黃，形狀大多數(shù)呈現(xiàn)鼓狀，外層具有天然的布狀外殼，具有細(xì)膩的口感和柔和的口味[1-2]。隨著時代的發(fā)展，Cheddar干酪已經(jīng)傳播到世界各地，尤其在歐美國家廣泛被生產(chǎn)和食用，因其口味相對溫和，在國內(nèi)也備受歡迎[3]。

隨著干酪工藝的不斷發(fā)展，產(chǎn)品的防腐與貯藏的問題也變得備受關(guān)注。天然防腐劑具有安全性高、高效以及不破壞產(chǎn)品原有品質(zhì)等優(yōu)勢，必將逐步代替化學(xué)防腐劑[4-5]。乳酸菌作為一種天然防腐劑，其代謝產(chǎn)物可以抑制致病菌和腐敗菌的生長繁殖，可有效延緩產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，延長產(chǎn)品的貨架期[6]。本研究對分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)食品中的植物乳桿菌SDZ的抑霉菌活性進(jìn)行了探究，并對添加該菌株生產(chǎn)Cheddar干酪的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料乳

原料乳為益得乳品廠提供的新鮮牛乳。

1.1.2 菌株

發(fā)酵用菌：嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、保加利亞乳酸桿(Lactobacillusbulgaricus)(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)SDZ(分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品)。

指示菌：黃曲霉、毛霉、黑曲霉、青霉、婁地青霉、地霉、寄生曲霉(中國微生物菌種保藏管理中心)。

1.1.3 試驗(yàn)主要試劑

CaCl2、NaCl、檸檬酸氫二銨、凝乳酶：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏、蛋白胨、細(xì)菌性蛋白胨，酵母提取粉、瓊脂：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；K2HPO4、MgSO4、MnSO4：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；無水葡萄糖：鴻之惠商貿(mào)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取粉5 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、無水乙酸鈉5 g/L、K2HPO42 g/L、Tween80 1 g/L、MgSO4200 mg/L、MnSO454 mg/L、無水葡萄糖20 g/L，pH值6.5，121 ℃下滅菌20 min。

脫脂乳培養(yǎng)基：脫脂乳粉100 g/L，酵母粉5 g/L，115 ℃下滅菌7 min。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯300 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，氯霉素0.1 g，pH 6.0，121 ℃下滅菌20 min。

水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂15 g/L，121 ℃下滅菌20 min。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD超凈工作臺：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RV-10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；SHB-Ш循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KDC-140HR高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；GHP隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX全自動高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；浦春JY系列電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；XH-C漩渦混勻器：常州未來儀器制造有限公司；PHS-3型pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；QTS25質(zhì)構(gòu)儀：深圳市科興精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SDZ代謝產(chǎn)物抑菌譜的建立

1.3.1.1 指示菌懸液的制備

將指示菌在PDA斜面劃線后28 ℃培養(yǎng)7 d，在斜面上加入5 mL生理鹽水，在漩渦儀上振蕩均勻，過濾菌絲，收集孢子懸液。利用血球計數(shù)板將孢子的濃度調(diào)節(jié)到106個/mL，備用[7]。

1.3.1.2 制備SDZ代謝產(chǎn)物

將SDZ凍干菌粉接種到MRS培養(yǎng)基中活化。取5 mL活化后的菌液到100 mL MRS培養(yǎng)基中進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，取菌液在4 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮20倍，得到SDZ代謝產(chǎn)物。

1.3.1.3 抑菌活性的測定

以霉菌為指示菌，采用牛津杯法測定植物乳桿菌SDZ的抑霉菌活性。將融化好的水瓊脂培養(yǎng)基倒入平板中，待瓊脂凝固后，在培養(yǎng)基上層放入牛津杯。之后將制備的指示菌懸液加入45 ℃的PDA培養(yǎng)基，倒在水瓊脂培養(yǎng)基上。待PDA培養(yǎng)基凝固后，在牛津杯中加入300 μL制備的SDZ代謝產(chǎn)物濃縮液，在28 ℃下培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈的直徑(含牛津杯直徑)[8]。

1.3.2 Cheddar干酪制作工藝

原料乳→巴氏殺菌(63 ℃，30 min)→冷卻→添加發(fā)酵劑→靜置培養(yǎng)→加凝乳酶(按1 g/10 kg添加)→中速攪拌(5 min)→保溫(32 ℃)→明顯凝乳→切割→熱燙(45 min內(nèi)升溫至39 ℃緩慢攪拌)→排乳清→堆釀(至排出乳清pH值為5.4)→攪碎→加鹽攪拌→壓榨→包裝

1.3.3 Cheddar干酪感官評價標(biāo)準(zhǔn)

邀請15位有經(jīng)驗(yàn)的評委組成感官評分小組，根據(jù)Cheddar干酪的整體風(fēng)味、組織狀態(tài)和色澤進(jìn)行綜合評定，評定時采用百分制，取平均數(shù)作為最終分?jǐn)?shù)[9-10]。感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 干酪感官評分表Table 1 The scoring criteria of cheese sensory evaluation

1.3.4 添加抑制霉菌特性乳酸菌生產(chǎn)Cheddar干酪工藝研究

1.3.4.1 菌種接種比例對Cheddar干酪感官評分的影響

將活化好的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌和植物乳桿菌SDZ菌株按照1∶1∶0.25、1∶1∶0.5、1∶1∶0.75、1∶1∶1和1∶1∶1.25的混合比例，以投放量為3%接種于原料乳中，在34 ℃下發(fā)酵30 min，根據(jù)感官評分確定最佳接種比例。

1.3.4.2 接種量對Cheddar干酪感官評分的影響

按照上述試驗(yàn)確定的最佳菌種接種比例將活化好的菌株，分別以接種量1%、2%、3%、4%和5%投放到原料乳中，在34 ℃下發(fā)酵30 min，根據(jù)感官評分確定植物乳桿菌SDZ最佳接種量。

1.3.4.3 發(fā)酵溫度對Cheddar干酪感官評分的影響

以最佳菌種比例，將活化好的菌株以確定的最佳接種量投放到原料乳中，分別在28、31、34、37、40 ℃下發(fā)酵30 min，根據(jù)感官評分確定最適發(fā)酵溫度。

1.3.4.4 發(fā)酵時間對Cheddar干酪感官評分的影響

將活化好的菌株按照最佳的接種比例和接種量，在最適發(fā)酵溫度下分別發(fā)酵15、20、25、30、35 min，根據(jù)感官評分確定最佳發(fā)酵時間。

1.3.4.5 通過響應(yīng)面分析確定Cheddar干酪最佳工藝

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對接種比例、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間4個影響因素，利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計模型開展響應(yīng)面分析，獲取最適工藝參數(shù)。

1.3.5 干酪理化指標(biāo)測定方法

1.3.5.1 蛋白質(zhì)測定

依據(jù)GB/T 5009.5—2016中的方法對產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定[11]。

1.3.5.2 脂肪測定

將干燥后的干酪進(jìn)行研磨，放于濾紙中進(jìn)行抽提，在抽提管內(nèi)加入無水乙醚至1/3，6～12 h后取下接收瓶，將濾紙放于干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥，稱量測定脂肪含量[12]。

1.3.5.3 水分測定

依據(jù)GB 5009.3—2016中的方法測定產(chǎn)品中水分[13]。

1.3.6 干酪的TPA測定

用QTS25質(zhì)構(gòu)儀測定樣品的硬度、彈性、凝聚性、膠著性、咀嚼性，回復(fù)性，每組樣品反復(fù)測定3次，取其平均值。質(zhì)構(gòu)儀具體參數(shù)設(shè)定為：探頭類型為P/50；測量前探頭下降速度為5.0 mm/s；測試速度為1.0 mm/s；下壓變形為50%；觸發(fā)力為0.2 N；

1.3.7 防腐效果的驗(yàn)證

1.3.7.1 防腐效果

將在最佳工藝條件下添加SDZ生產(chǎn)的Cheddar干酪，與傳統(tǒng)菌株生產(chǎn)的Cheddar干酪25 ℃裸露放置貯藏。測定干酪成品的霉菌數(shù)，每天連續(xù)記錄產(chǎn)品中的霉菌數(shù)，從而獲得菌落數(shù)指標(biāo)，觀察其防腐效果[14]。

1.3.7.2 成品干酪中霉菌計數(shù)方法

根據(jù)GB 4789.15—2016中的方法對霉菌進(jìn)行計數(shù)[15]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 19.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)表示方式為(平均數(shù)±方差)，作圖工具為Origin 7.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌SDZ的抑菌譜

植物乳桿菌SDZ的抑菌譜試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。SDZ對毛霉、黃曲霉和黑曲霉抑菌效果較好；對青霉也具有良好的抑制作用；對婁地青霉和寄生曲霉抑制效果一般；對地霉無抑制作用。綜上可知，SDZ對于霉菌有較為廣譜的抑菌性。

表2 抑菌譜Table 2 Antifungal spectrum of strains

注：“+”表示抑菌圈直徑介于7～10 mm；“++”表示抑菌圈直徑介于10～15 mm；“+++”表示抑菌圈直徑介于15～18 mm；“++++”表示抑菌圈直徑大于18 mm；“-”表示無抑菌效果。

2.2 菌種接種比例對Cheddar干酪感官評分的影響

將活化好的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌SDZ按照不同的比例添加到原料乳中，對制作好的干酪進(jìn)行感官評定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同接種比例對干酪感官評分的影響Fig.1 Effect of mixed proportion of different strains sensory evaluation of cheese

由圖1可知，不同接種比例對干酪產(chǎn)品的感官評分影響很大。在嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌SDZ的比例為1∶1∶0.5時，制作出的干酪具有良好的感官評分，明顯高于其他接種比例的組分。

2.3 接種量對Cheddar干酪感官評分的影響

將發(fā)酵菌株以最佳接種比例，分別添加不同的量制作干酪，并進(jìn)行感官評定，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同接種量對干酪感官評分的影響Fig.2 Effect of different inoculation amount of strain on sensory evaluation of cheese

從圖2可以看出，不同接種量對干酪感官評分影響顯著，發(fā)酵菌株添加量為3%時，所得干酪的感官評分明顯高于其他組分。

2.4 發(fā)酵溫度對Cheddar干酪感官評分的影響

采用最佳的接種比例和接種量，分別在不同溫度下發(fā)酵制作干酪，并對所得干酪進(jìn)行感官評定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同發(fā)酵溫度對干酪感官評分的影響Fig.3 Effect of different temperature on the sensory evaluation of cheese

從圖3可以看出，40 ℃所得干酪與37 ℃所得干酪感官評分明顯高于其他組分，且兩者相差無幾，但考慮到生產(chǎn)實(shí)際和成本，采用37 ℃作為最佳發(fā)酵溫度。

2.5 發(fā)酵時間對Cheddar干酪感官評分的影響

采用最佳的接種比例、接種量和發(fā)酵溫度，分別在不同的時間下制作干酪，然后對產(chǎn)品進(jìn)行感官評定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同發(fā)酵時間對干酪感官評分的影響Fig.4 Effect of different fermentation time on the sensory evaluation of cheese

從圖4可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)品的感官評分逐漸升高，在25 min時達(dá)到最高，隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)延長，感官評分反而會下降。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化Cheddar干酪制作工藝

2.6.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

依據(jù)單因素試驗(yàn)分析結(jié)果，以感官評分(Y)為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6設(shè)計四因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)。響應(yīng)面模型因素與水平設(shè)計見表3。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果如表4所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and their levels of response surface design

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 4 Response surface design arrangement and corresponding experimental data

2.6.2 回歸方程的建立

利用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件，對所得4個因素擬合得到感官評定評分(Y)的回歸方程為：

Y=94.30+0.11A+0.86B-0.33C+0.37D-2.33AB-1.00AC-1.70AD-4.75BC-2.75BD-4.95CD-6.38A2-5.36B2-6.60C2-6.07D2

2.6.3 方差分析

應(yīng)用回歸分析對方程和方程的各因子進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果如表5所示。

注：“**”表示極顯著(p<0.01)；“*”表示顯著(0.01

從表5中可知，接種比例、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對干酪感官評分影響極顯著(各二次方項p<0.01)。接種比例與接種量、接種量與發(fā)酵溫度、接種量與發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間的交互作用極顯著(p<0.01)，接種比例與發(fā)酵時間的交互作用顯著(0.010.05)。

2.6.4 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

考慮在某兩個因素固定在中心值不變的條件下，另外兩個因素的交互作用對Cheddar干酪感官的影響，繪制出三維立體響應(yīng)曲面。結(jié)果如圖5所示。

圖5 接種比例、接種量、溫度、時間交互作用對 感官評分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between mixed proportion of different strains， Inoculation amount，temperature and fermentation time

從圖5可以看出，AC之間交互作用對于感官評分影響不顯著(等高線接近圓形)，其余各因素之間兩兩交互作用對感官評分的影響顯著(等高線為橢圓形)，各因素之間兩兩交互作用對感官評分的影響強(qiáng)度由強(qiáng)到弱依次為：BC>CD>BD>AB>AD>AC，這與方差分析的結(jié)果是一致的。

通過該回歸方程求解優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)為：接種比例為1∶1∶0.61，接種量為2.98%，發(fā)酵溫度為36.90 ℃，發(fā)酵時間為24.80 min，此條件下干酪成品的感官評分可達(dá)91.177 4分。經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)，此條件下生產(chǎn)干酪的感官評分平均為(92.30±0.83) 分，接近于預(yù)測分?jǐn)?shù)，說明模型可以較好地預(yù)測實(shí)際情況。

2.7 干酪成品理化指標(biāo)的測定結(jié)果

取最優(yōu)條件下生產(chǎn)的干酪進(jìn)行理化指標(biāo)的鑒定，結(jié)果見表6。

表6 理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 6 The results of physical and chemical indicators

注：小寫字母不同表示組分間差異顯著(p>0.05)。

由表6可以看出，添加植物乳桿菌SDZ生產(chǎn)的干酪與添加傳統(tǒng)菌株生產(chǎn)的干酪水分含量、蛋白質(zhì)含量差異顯著。由此可以看出添加植物乳桿菌SDZ不會對干酪的理化指標(biāo)產(chǎn)生較大影響。

2.8 干酪成品TPA測定結(jié)果

將在最佳工藝條件下生產(chǎn)的干酪進(jìn)行質(zhì)地剖面分析(texture profile analysis, TPA)測定，結(jié)果見表7。

表7 TPA測定結(jié)果Table 7 The results of TPA measurement

注：小寫字母不同表示組分間差異顯著(p>0.05)。

由7表可以看出，添加植物乳桿菌SDZ在最優(yōu)工藝條件下生產(chǎn)的干酪硬度適中，彈性好，內(nèi)聚性良好，膠著性和黏性良好，咀嚼性和回復(fù)性都優(yōu)于傳統(tǒng)菌株生產(chǎn)的干酪。

2.9 抑菌效果研究

將最佳工藝下生產(chǎn)的Cheddar干酪，與傳統(tǒng)菌株生產(chǎn)的Cheddar干酪，在25 ℃下裸露放置，霉菌數(shù)測定結(jié)果如表8所示。

表8 25 ℃裸露放置干酪成品中霉菌數(shù)(CFU/g)測定Table 8 The results of mold populations by exposed treatment during storage at 25 ℃

注：小寫字母不同表示組分間差異顯著(p>0.05)；“-”表示霉菌生長過于多且連成一團(tuán)，不可計數(shù)。

從表8可以看出，傳統(tǒng)菌株發(fā)酵生產(chǎn)的Cheddar干酪在25 ℃下裸露放置2 d后，霉菌數(shù)就已經(jīng)超出國標(biāo)的要求(國標(biāo)規(guī)定霉菌數(shù)不得超過50 CFU/g)，而添加SDZ生產(chǎn)的Cheddar干酪在25 ℃下裸露放置5 d后，霉菌數(shù)才超標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，與添加傳統(tǒng)菌株生產(chǎn)的Cheddar干酪相比，添加SDZ可以有效抑制Cheddar干酪的霉菌污染，從而延長產(chǎn)品的貯藏期。

3 結(jié)論

植物乳桿菌SDZ對于霉菌有較為廣譜的抑菌性。添加SDZ生產(chǎn)Cheddar干酪的最佳工藝參數(shù)為：接種比例1∶1∶0.61，接種量2.98%，發(fā)酵溫度36.90 ℃，發(fā)酵時間24.80 min，在此工藝參數(shù)下所得產(chǎn)品硬度適中，彈性好，內(nèi)聚性適中，膠黏性良好，感官評分明顯優(yōu)于對照組。產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量為15.3%，脂肪含量為22.4%，水分含量為46%，與傳統(tǒng)菌株生產(chǎn)的干酪差別不大。產(chǎn)品在25 ℃下敞口放置霉菌超標(biāo)的日期高于傳統(tǒng)菌株發(fā)酵制得干酪，表明添加植物乳桿菌SDZ可以有效延長干酪的保質(zhì)期。