劉凡，仇鈺瑩，周新虎，陳翔，李喆，陳堅，堵國成，方芳*

1(江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫,214122) 2(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫,214122) 3(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇 宿遷,223800) 4(江南大學，糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫,214122) 5(江南大學，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫,214122)

濃香型白酒是我國傳統(tǒng)的酒精飲料，其產(chǎn)銷量居各香型白酒之首，以“窖香濃郁、綿柔醇厚、口感綿甜和尾凈余長”的風格著稱[1-2]。有機酸是濃香型白酒中重要的呈味物質(zhì)，適當比例的有機酸能使酒體更加飽滿，有利于消除白酒中的苦味并促進新酒老熟[3-4]。己酸、乳酸、乙酸和丁酸占白酒中有機酸含量的90%以上，被稱為白酒的“四大酸”，其含量和比例的變化對白酒風味形成具有重要作用[5]。四大酸一方面是白酒中主要酯類物質(zhì)如乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯(濃香型白酒的主體香味物質(zhì))和丁酸乙酯合成的重要前體，其含量決定了濃香型白酒香型的形成[6-7]；另一方面，白酒中四大酸含量適宜時有助于白酒風味的提升，而任一有機酸過量時則會破壞白酒風味組成平衡。例如，己酸對白酒有呈味助香的功能，其濃度過高則導致酒體渾濁。丁酸具有愉悅的水果香味，能顯著增強白酒“窖香”，但過量則有不愉快的汗臭味[8]產(chǎn)生。乳酸能抑制有害微生物的繁殖，在穩(wěn)定白酒香氣，降低酒體苦澀和糙辣感方面也有重要作用，過量乳酸存在則會導致酒體酸澀，影響白酒口感[9]。乙酸能有效烘托和緩和白酒主體香味，過量乙酸則會破壞酒體風格，抑制白酒香味[10]。

目前，通過分離產(chǎn)酸微生物并分析菌株的生理生化特性和產(chǎn)酸性能等相關研究證實細菌是濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中有機酸的主要產(chǎn)生者[11-12]。其中，梭狀芽孢桿菌是丁酸和己酸合成的主要微生物。梭狀芽孢桿菌在酒醅中的含量極少(相對豐度<0.01%)，主要存在(自然存在或人工強化)于窖泥中[13]。此外，醋桿菌有較強合成乙酸的能力，而以乳桿菌屬為主的乳酸菌是乳酸合成的重要微生物，乳桿菌進行異型乳酸發(fā)酵代謝時也能產(chǎn)生乙酸[14]。上述研究僅驗證了分離出的微生物具有代謝產(chǎn)生有機酸的能力，并未闡明相應產(chǎn)酸微生物尤其是與乙酸和乳酸合成相關的微生物在白酒發(fā)酵不同階段以及真實混菌發(fā)酵體系中對有機酸合成的影響。統(tǒng)計學分析手段雖已廣泛應用于分析白酒微生物群落與代謝產(chǎn)物合成的相互關系[15-16]，然而，通過分離微生物并研究其代謝能力仍是闡釋白酒發(fā)酵機制和提高白酒品質(zhì)的根本途徑[17]。因此，在獲得可培養(yǎng)微生物的前提下，結合分子生物學和統(tǒng)計學分析揭示白酒發(fā)酵過程中微生物與有機酸合成的相互關系對提升白酒風味具有重要意義。

通過分離產(chǎn)酸微生物并驗證菌株產(chǎn)有機酸的能力，將產(chǎn)酸微生物數(shù)量動態(tài)變化與白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程酒醅中有機酸含量變化進行相關性分析，由此確定白酒發(fā)酵不同階段對乳酸、乙酸合成有重要影響的功能微生物，為闡釋白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程的微生物產(chǎn)酸機理和提高白酒品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒醅樣品

濃香型白酒酒醅取自江蘇洋河酒廠股份有限公司濃香型白酒生產(chǎn)窖池。采樣方式：分別在窖池上、中、下3層采集樣品，混勻后作為1個酒醅樣品。在60 d的發(fā)酵周期內(nèi)，分別取發(fā)酵0、3、6、15、20、30、45和60 d的酒醅樣品，各發(fā)酵時間點樣品均取自2個不同的窖池，并及時保存于-20 ℃冰箱。

1.1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌篩選培養(yǎng)基(g/L): MRS培養(yǎng)基，輕質(zhì)CaCO35.0(單獨滅菌，倒平板前加入)，鈉他霉素0.05，瓊脂20.0。

醋酸菌篩選培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10.0，酵母膏10.0，輕質(zhì)CaCO35.0(單獨滅菌，倒平板前加入)，鈉他霉素 0.05，瓊脂 20.0。培養(yǎng)基使用前加30 g/L的無水乙醇。

其他產(chǎn)酸細菌篩選培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5.0、蛋白胨10.0、輕質(zhì)CaCO35.0(單獨滅菌，倒平板前加入)，瓊脂20.0。

糧食浸出培養(yǎng)基：將生產(chǎn)洋河濃香型白酒所用五糧(高粱、小麥、玉米、糯米、和大米)按比例混合粉碎，添加4倍體積水和高溫淀粉酶(1 000 U/kg)蒸煮糊化1 h，迅速冷卻至60 ℃以下后加入糖化酶(3 000 U/kg)，于60 ℃下糖化2 h，紗布過濾，上清液調(diào)整糖度至13～14 ° Bx。

1.2 主要試劑和儀器

乳酸和乙酸標準品(≥99.5%),Sigma-Aldrich公司；Primer STAR?Max DNA Polymerase、SYBR?PremixEx TaqTMⅡ：大連寶生物工程有限公司;PowerMax?Soil DNA isolation kit試劑盒：MOBIO公司；鈉他霉素：青島寶博公司；其他試劑均購買自國藥集團化學試劑有限公司。

高效液相色譜儀(安捷倫1260)，美國安捷倫公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計，美國Thermo Fisher公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司；羅氏LightCycler?480 Ⅱ熒光定量PCR儀，美國Molecular devices公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)酸菌株的分離

稱取10 g酒醅樣品，與90 mL無菌生理鹽水(9 g/L NaCl)混勻，梯度稀釋后取10-2、10-3、10-4梯度稀釋液分別涂布于乳酸菌篩選培養(yǎng)基、醋酸菌篩選培養(yǎng)基和其他產(chǎn)酸細菌篩選培養(yǎng)基。芽孢桿菌的分離采用將酒醅與生理鹽水的混合物在85 °C水浴處理30 min，梯度稀釋后選擇10-2、10-3、10-4梯度稀釋液涂布于上述篩選培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基平板分別以需氧(靜置培養(yǎng))和厭氧(厭氧箱培養(yǎng))2種方式在37 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑選有明顯透明圈的單菌落進行分離純化、鑒定和保藏。

1.3.2 產(chǎn)酸細菌屬水平鑒定

利用細菌基因組提取試劑盒提取上述篩選菌株基因組，利用16S rRNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對菌株基因組進行擴增。PCR擴增條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司測序，測序結果與NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中序列進行Blast比對，利用MEGA 6.0軟件構建進化樹[18]，確定菌株所屬微生物屬。

1.3.3 酒醅中細菌的絕對數(shù)量測定

酒醅中微生物宏基因組DNA制備采用液氮研磨結合試劑盒抽提的方法[19]。稱取5 g酒醅樣品至研缽中，加入液氮充分研磨使細胞破碎。使用PowerMax?Soil DNA Isolation Kit試劑盒提取微生物宏基因組DNA，提取步驟參照說明書進行。提取得到的基因組DNA用NanoDrop 2000超微量分光光度計進行基因組濃度和純度的檢測，合格樣品于-20 ℃冰箱保存。

對酒醅中產(chǎn)酸微生物的絕對定量分析采用各菌屬的16S rDNA特異性引物[20-21](表1)，利用熒光定量PCR對白酒窖內(nèi)發(fā)酵酒醅中Bacillus、Lactobacillus、Lactococcus、Weissella、Acetobacter和Pediococcus等菌屬的微生物進行定量。將各菌屬16S rDNA基因擴增產(chǎn)物連接至PUC57載體，構建成標準質(zhì)粒，標準質(zhì)?？截悢?shù)的計算參考文獻[19]。根據(jù)擴增曲線，以閾值循環(huán)數(shù)Ct(即每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))作為橫坐標，標準濃度的對數(shù)作為縱坐標繪制標準曲線，利用標準曲線計算各微生物的生物量。實時熒光定量PCR采用25 μL反應體系：DNA模板10 ng，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL，SYBR?PremixEx TaqTMⅡ 12.5 μL，使用無菌水補足體系。定量PCR擴增程序：95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性 5 s，58 ℃退火 30 s，65 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。

表1 RT-PCR引物Table 1 Primers used for RT-PCR

1.3.4 菌株產(chǎn)酸能力分析

將菌株在糧食浸出培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)72 h后(醋桿菌培養(yǎng)添加30 g/L無水乙醇，靜置培養(yǎng)，其余微生物厭氧培養(yǎng))，8 000 r/min離心20 min后取上清液，用0.22 μm水系濾膜過濾，利用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中有機酸的含量。

依據(jù)洋河濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程溫度(22～32 ℃)、酒醅中乙醇含量(小于70 g/L)和初始pH值(小于7.0)的變化特點[22-23]，確定考察窖內(nèi)發(fā)酵環(huán)境因素對菌株產(chǎn)酸能力影響的條件為：溫度選擇22、27、32、37 ℃；乙醇含量考察0、10、30、50、70 g/L 5個梯度；培養(yǎng)基初始pH值考察3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。以5%(體積分數(shù))的接種量將菌株接種至糧食浸出培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后(醋桿菌在有氧、加入30 g/L無水乙醇條件下培養(yǎng)，其他微生物進行厭氧培養(yǎng))，檢測發(fā)酵液中有機酸含量。

有機酸含量的測定：處理后的樣品用高效液相色譜法進行檢測。液相色譜檢測器為紫外檢測器，在210 nm波長處，色譜柱為HPLC organic acid analysis column(300 mm×7.8 mm)，檢測條件參照文獻[24]。以乳酸和乙酸為標準品繪制相應標準曲線，計算有機酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對產(chǎn)酸微生物生物量與乳酸、乙酸含量進行Pearson相關性分析，|r|>0.7且p<0.05代表高度顯著性相關。

2 結果與分析

2.1 酒醅中產(chǎn)酸菌株的分離與鑒定

利用產(chǎn)酸菌株可溶解CaCO3的選擇性分離培養(yǎng)方法從洋河濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵不同時期的酒醅中分離得到163株有明顯透明圈的菌株。通過對分離菌株的菌落形態(tài)進行觀察，依據(jù)《一般細菌常用鑒定方法》[25]對菌株進行初步鑒定，選擇代表不同菌落形態(tài)的菌株用于菌種鑒定和后續(xù)研究。分離獲得的細菌菌株，進一步鑒定，通過測定其16S rRNA基因序列，并將測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進行比對，當16S rRNA基因序列相似度≥99%時可認定為1個種[26]。最終從酒醅中分離得到的12株產(chǎn)酸菌株(16S rRNA基因序列相似度均≥99%)，分別屬于6個屬12個種，包括戊糖足球菌(Pediococcuspentosaceus)JP1、嗜酸乳酸足球菌(Pediococcusacidilactici)JP2、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)JP3、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)JP4、陰道乳桿菌(Lactobacillusvaginalis)JP5、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)JP6、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)JP7、食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)JP8、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)JP9、巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)JP10、東方醋桿菌(Acetobacterorientalis)JP11和蘋果醋桿菌(Acetobactermalorum)JP12，如圖1所示。

2.2 菌株產(chǎn)有機酸能力分析

圖1 分離自濃香型白酒酒醅細菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic tree of bacterial strains isolated from fermented grains for producing Chinese strong-aroma spirit 注：以細菌16S rRNA基因構建進化樹，分支點數(shù)值表示置信度，比例尺表示堿基替換率，0.02表示2%的序列差異；括號內(nèi)序號表 示與測序結果最相近的GenBank登錄號。

從酒醅中分離得到的12株細菌在糧食浸出培養(yǎng)基中分別進行培養(yǎng)和發(fā)酵(醋桿菌進行有氧培養(yǎng)，其他細菌進行厭氧培養(yǎng))。由圖2可以看出，在相應培養(yǎng)條件下，醋桿菌只產(chǎn)乙酸，乳酸菌和芽孢桿菌只產(chǎn)乳酸。醋桿菌中A.pasteurianusJP10可以合成4.40 g/L乙酸，其產(chǎn)乙酸能力分別是A.orientalisJP11及AcetobactermalorumJP12的1.79倍和2.20倍。產(chǎn)乳酸的菌株中L.plantarumJP3生成乳酸能力最強，達到8.59 g/L；P.acidilacticiJP2、L.pentosusJP4、B.amyloliquefaciensJP6、W.cibariaJP8和Lat.garvieaeJP9合成乳酸能力次之(5.22～7.31 g/L)；P.pentosaceusJP1、L.vaginalisJP5和B.cereusJP7合成乳酸水平相對較低。

圖2 分離自酒醅的菌株產(chǎn)有機酸能力Fig.2 The ability of strains isolated from fermented qrains to produce organic acids

2.3 濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程酒醅中產(chǎn)酸微生物的定量分析

白酒窖內(nèi)發(fā)酵是微生物群體參與的發(fā)酵過程，有機酸的合成和積累水平與具有該能力菌株的數(shù)量和可調(diào)控有機酸合成代謝途徑的環(huán)境因素密切相關。因此，建立所分離菌株與洋河濃香型白酒中乳酸和乙酸合成之間的明確關系，需要在分析菌株合成有機酸能力的基礎上，解析窖內(nèi)發(fā)酵過程中產(chǎn)酸菌株數(shù)量變化與有機酸合成之間的相關性，并闡明白酒窖內(nèi)發(fā)酵工藝條件對菌株合成有機酸水平的影響。

依據(jù)從洋河濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程酒醅中分離得到的產(chǎn)酸細菌菌屬，通過qRT-PCR對6個菌屬的絕對數(shù)量進行了分析，結果如圖3所示。窖內(nèi)發(fā)酵過程中Lactobacillus(106～109copies/g)和Bacillus(106～108copies/g)是數(shù)目最多的兩類細菌。Lactobacillus數(shù)量在窖內(nèi)發(fā)酵0～20 d增加了2個數(shù)量級，最高為3.9×109copies/g，21～60 d數(shù)量逐漸減少，發(fā)酵結束時Bacillus和Lactobacillus數(shù)量與起始數(shù)量接近。Bacillus數(shù)量在0～15 d增加了1個數(shù)量級，15 d后數(shù)量逐漸減少，到發(fā)酵結束時下降了1個數(shù)量級。Weissella生物量在發(fā)酵0～3 d增加了1個數(shù)量級，3～60 d其數(shù)目減少了2個數(shù)量級。Acetobacter數(shù)量在發(fā)酵0～6 d，增加了1個數(shù)量級, 6～60 d數(shù)量減少了3個數(shù)量級。Lactococcus和Pediococcus數(shù)量在白酒窖內(nèi)發(fā)酵整個階段均無明顯變化，分別在105～106copies/g和104～105copies/g。

圖3 濃香型白酒發(fā)酵過程酒醅中產(chǎn)酸細菌數(shù)量變化Fig.3 Quantification of bacteria in fermented grains during Chinese strong-aroma spirit fermentation

2.4 白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程酒醅中產(chǎn)酸細菌與有機酸合成的相關性分析

在前期研究中，對洋河濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程相同酒醅中乳酸和乙酸含量變化的分析已證實：窖內(nèi)發(fā)酵前期酒醅中乳酸和乙酸含量明顯降低，出窖60 d時乳酸和乙酸含量分別比入窖時增加了18.8%和60.4%；同時根據(jù)酒醅屬水平優(yōu)勢微生物組成差異，酒醅樣品被明顯區(qū)分為0～15 d和15～60 d兩個階段[27]。在此基礎上，結合本研究結果，利用SPSS統(tǒng)計分析軟件對酒醅產(chǎn)酸微生物生物量與白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中乙酸、乳酸含量進行了相關性分析。由圖4-A可知，洋河濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵0～15 d，乳酸合成與Weissella、Bacillus、Lactobacillus和Pediococcus4個菌屬的總量呈高度顯著正相關(r=0.923，p<0.05)，其中Weissella(r=0.975，p<0.05)是與乳酸正相關性最好的微生物；乙酸的生成則與Acetobacter，Bacillus和Weissella3個屬的總生物量呈高度顯著正相關(r=0.852，p<0.05)，其中Acetobacter與乙酸的正相關性最好(r=0.976,p<0.05)。窖內(nèi)發(fā)酵15～60 d，乙酸與Lactococcus、Weissella、Bacillus和Lactobacillus4個屬的總生物量呈高度顯著正相關(r=0.801，p<0.05)；Lactobacillus是與乳酸合成高度顯著正相關(r=0.741，p<0.05)的菌屬(圖4-B)。上述分析表明，分離自洋河濃香型白酒酒醅的6個菌屬均與白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程酒醅中乙酸和乳酸的生成呈正相關。

A-白酒窖內(nèi)發(fā)酵0～15 d；B-白酒窖內(nèi)發(fā)酵15～60 d圖4 產(chǎn)酸細菌與酒醅中有機酸合成的相關性分析Fig.4 The correlation analysis between organic acids producing-bacteria in fermented grains and organic acids biosynthesis 注：箭頭上方所標數(shù)值大于0.7時，表示兩者具有高度正相關性，數(shù)值越接近 1.0表示兩者相關性越好；*表示p <0.05。

2.5 環(huán)境因素對菌株產(chǎn)酸的影響

濃香型白酒生產(chǎn)過程中窖內(nèi)環(huán)境的變化對微生物代謝合成有機酸的能力有顯著影響[28]。為了分析分離菌株在白酒工藝條件改變時產(chǎn)酸能力變化，該研究考察了白酒發(fā)酵過程中的主要影響參數(shù)如溫度、乙醇含量和培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酸的影響。根據(jù)菌株產(chǎn)單一有機酸能力強弱和微生物屬種關系，選擇了產(chǎn)乙酸能力最強的醋桿菌(A.pasteurianusJP10)以及產(chǎn)乳酸能力較強的乳酸菌(P.acidilacticiJP2、L.plantarumJP3、W.cibariaJP8、Lat.garvieaeJP9)和芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) JP6這6種菌株進行產(chǎn)酸性能的研究。

溫度對乳酸菌和芽孢桿菌產(chǎn)乳酸能力的影響較小，對A.pasteurianusJP10產(chǎn)乙酸能力的影響較為顯著(圖5)。

圖5溫度對菌株產(chǎn)有機酸的影響Fig.5 Effect of temperature on producing organic acids by fermented grains isolates

在22 ℃靜置培養(yǎng)條件下A.pasteurianusJP10產(chǎn)乙酸能力為0.45 g/L，37 ℃時產(chǎn)乙酸量最多，是22 ℃下的4.96倍。

隨著白酒窖內(nèi)發(fā)酵的進行，酒醅中乙醇含量逐漸增加，對微生物的生長和代謝均有不同程度的影響[29]。如圖6所示，在培養(yǎng)基中添加0～70 g/L乙醇并在厭氧條件下培養(yǎng)對P.acidilacticiJP2、L.plantarumJP3和B.amyloliquefaciensJP6產(chǎn)乳酸能力沒有顯著影響。0～30 g/L乙醇條件下進行厭氧培養(yǎng)時W.cibariaJP8產(chǎn)乳酸能力較強(2.79～2.96 g/L)，乙醇添加量為70 g/L時產(chǎn)乳酸能力最弱(1.45 g/L)，相比10 g/L乙醇含量時降低了51.0%。Lat.garvieaeJP9產(chǎn)乳酸能力在10～30 g/L乙醇時較高(2.94～3.29 g/L)，50 g/L乙醇時產(chǎn)乳酸含量迅速下降，相比30 g/L降低了54.6%。有氧條件下，醋桿菌可將乙醇氧化生成乙酸，因此適當?shù)囊掖己繉σ宜嵘捎写龠M作用[30]。無乙醇靜置培養(yǎng)時，A.pasteurianusJP10沒有產(chǎn)生乙酸的能力，乙醇含量為50 g/L時乙酸含量最高(1.75 g/L)，是10 g/L的1.67倍。

圖6 乙醇對菌株產(chǎn)有機酸的影響Fig.6 Effect of ethanol on producing organic acids by fermented grains isolates

從圖7可知，在培養(yǎng)基初始pH 3.0下厭氧培養(yǎng)時，乳酸菌和芽孢桿菌產(chǎn)乳酸含量均低于1 g/L，而培養(yǎng)基初始pH值的提高有助于乳酸的合成。其中，L.plantarumJP3產(chǎn)乳酸含量在培養(yǎng)基初始pH為6.0時達到最高(8.60 g/L)，其余菌株產(chǎn)乳酸能力在pH 7.0時最強。在培養(yǎng)基初始pH為3.0～4.0條件下進行靜置培養(yǎng)時，A.pasteurianusJP10產(chǎn)乙酸能力為0.72～0.76 g/L，培養(yǎng)基初始pH 6.0時該菌株產(chǎn)乙酸含量達到最高值(1.40 g/L)，是pH 3.0下乙酸產(chǎn)量的1.94倍。

圖7 培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酸的影響Fig.7 Effect of initial pH of cultivation medium on producing of organic acids by fermented grains isolates

3 結論與討論

濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中，酒醅細菌微生物是乙酸和乳酸的主要產(chǎn)生者。乙酸和乳酸作為白酒中的主要有機酸，是乙酸乙酯和乳酸乙酯的重要前體，且乙酸在己酸菌和丁酸菌作用下，能與乙醇等轉(zhuǎn)化生成己酸和丁酸[31-33]。因此，明確酒醅微生物與乳酸、乙酸等有機酸合成的相互關系，能有效維持白酒風味的平衡。

本研究利用3種篩選培養(yǎng)基從濃香型白酒酒醅中得到6個屬產(chǎn)酸微生物，分別為Lactobacillus、Lactococcus、Weissella、Bacillus、Acetobacter和Pediococcus。這與栗連會等從濃香型白酒酒醅中分離得到Lactobacillus、Pediococcus、Bacillus等產(chǎn)酸微生物和孫鵬飛等從白酒酒醅中分離得到Bacillus、Acetobacter、Weissella等產(chǎn)酸微生物的結論基本一致[34-35]。進一步通過高效液相色譜和qRT-PCR分別對12種菌株產(chǎn)有機酸能力和6個屬的產(chǎn)酸細菌進行了絕對定量分析，并對白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程酒醅產(chǎn)酸微生物生物量與乳酸、乙酸含量進行了相關性分析，發(fā)現(xiàn)白酒發(fā)酵0～15 d時，乙酸、乳酸均與多種產(chǎn)酸微生物總量呈高度顯著正相關，同時乙酸與Acetobacter、乳酸與Weissella均呈高度顯著正相關。發(fā)酵15～60 d時，乳酸合成僅與Lactobacillus呈高度顯著正相關，乙酸僅與4個屬微生物總量呈高度顯著正相關。說明由于濃香型白酒發(fā)酵前期細菌優(yōu)勢微生物種類較豐富，乙酸和乳酸的合成受多種微生物的共同影響，且Acetobacter和Weissella是該階段影響乙酸和乳酸含量的主導微生物。同時，濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵中后期Lactobacillus生物量在產(chǎn)酸微生物中占有優(yōu)勢地位，乳酸合成僅與Lactobacillus呈高度顯著正相關關系是導致濃香型白酒實際生產(chǎn)中乳酸及乳酸乙酯含量居高不下的主要原因。過量的乳酸會對窖池環(huán)境造成破壞，導致窖池板結和退化。乳酸乙酯含量過高則會導致酒體單調(diào)，影響白酒風味平衡[34,36]。通過考察白酒窖內(nèi)發(fā)酵的3個重要參數(shù)(溫度、乙醇含量和初始pH)與分離菌株產(chǎn)酸性能的關系發(fā)現(xiàn)，溫度、乙醇含量和初始pH的變化均對醋酸菌產(chǎn)乙酸能力有顯著影響。溫度對乳酸菌和芽孢桿菌產(chǎn)乳酸無明顯影響，乙醇含量與部分乳酸菌產(chǎn)乳酸能力有關，初始pH變化則對所有分離菌株產(chǎn)乳酸能力均有顯著作用：較低初始pH抑制菌株產(chǎn)酸能力，初始pH 6.0～7.0時菌株產(chǎn)乳酸能力明顯提高。因此，初始pH是影響乳酸菌和芽孢桿菌產(chǎn)乳酸的主要環(huán)境因素。通過調(diào)節(jié)入窖時的初始pH值，對合理調(diào)控白酒乳酸含量，實現(xiàn)濃香型白酒“增己降乳”具有重要意義。

綜上所述，通過微生物分離技術、qRT-PCR及統(tǒng)計學分析手段的有機結合，可實現(xiàn)對可培養(yǎng)微生物在白酒復雜釀造環(huán)境中代謝功能的全面分析，為闡明白酒產(chǎn)酸機理和提升白酒品質(zhì)提供借鑒。然而，白酒窖內(nèi)發(fā)酵15～60 d，酒醅微生物與Lactococcus、Weissella、Bacillus和Lactobacillus的總量呈高度顯著正相關，表明這4個屬的部分菌株具有明顯產(chǎn)生乙酸的能力，但由于篩選條件的局限性，在白酒釀造中后期并未成功分離到高產(chǎn)乙酸的菌株。今后可利用高通量篩選和宏轉(zhuǎn)錄組學技術，對濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中微生物與有機酸合成的相互關系進行更加深入、系統(tǒng)的研究。