閆 雪 袁小凡 趙慶余 張藝峰 張 麗 張昭強(qiáng)

(1.泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000； 2. 泰安市中醫(yī)醫(yī)院功能檢查科，山東 泰安 271000)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)包括靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢步態(tài)異常，以黑質(zhì)(substantia nigra, SN)多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元退行性變性死亡和殘存的神經(jīng)元內(nèi)形成Lewy小體(Lewy bodies，LBs)為主要病理特征[1]。盡管PD病因現(xiàn)今并未明確，包括遺傳、基因突變、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和環(huán)境因素等多種原因都參與了PD的發(fā)病過程[2]。環(huán)境中的有害物質(zhì)已被證實(shí)是PD的重要致病因素之一，已經(jīng)越來越引起人們的重視[3]。魚藤酮(Rotenone)是一種從豆科植物中提取的脂溶性的殺蟲劑，可以透過血腦屏障進(jìn)而造成黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性的死亡[4]。近年來已有多項(xiàng)研究證實(shí)魚藤酮給藥后，可以成功制作包括大小鼠在內(nèi)的不同的PD動物模型[5-6]。但相應(yīng)模型的制作方法具有操作復(fù)雜、需要特殊設(shè)備、費(fèi)用昂貴和模型成功率低等缺點(diǎn)，并未在PD的研究中廣泛應(yīng)用。本研究通過長期小劑量給予Wistar大鼠腹腔注射魚藤酮中鏈甘油三酯乳液(medium-chain triglyceride, MCT)，通過對動物行為學(xué)和黑質(zhì)病理的相關(guān)檢測，成功制作出了操作簡便、成功率高的PD大鼠模型，并對其行為學(xué)及病理學(xué)變化進(jìn)行了檢測，以期為今后PD進(jìn)一步的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 大鼠分組及處理

雄性Wistar大鼠32只(清潔級，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供)，體重(280±20)g，喂養(yǎng)室溫20～24 ℃，50%～60%相對濕度，在12∶12 h循環(huán)晝夜光照條件下生活，自由取食、飲水。將動物隨機(jī)分為4組，包括正常對照組8只，生理鹽水對照組8只，溶劑對照組8只，魚藤酮模型組8只。正常對照組不做任何處理，生理鹽水對照組腹腔注射生理鹽水1 ml/(kg·d)，溶劑對照組腹腔注射無魚藤酮的MCT溶劑1 ml/(kg·d)，魚藤酮模型組腹腔注射魚藤酮藥物(3 mg/mL)1 ml/(kg·d)，各組大鼠均連續(xù)注射21天。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)1周實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。

1.2 大鼠行為學(xué)檢測

1.2.1方橋?qū)嶒?yàn) 將木質(zhì)方橋置于置物架上，離地60 cm。將不同組別的大鼠放置于方橋中間，記錄大鼠在方橋上的存留時間，如果大鼠一直存留在方橋上，最長記錄時間為120 s。大鼠間隔10 min以上進(jìn)行重復(fù)測量，計(jì)測3次后取平均值。

1.2.2曠場實(shí)驗(yàn) 將待測大鼠輕放入方盒(55cm× 55cm× 50 cm)中央，通過視頻采集分析系統(tǒng)自動記錄10 min的大鼠自主活動。使用美國Deacon公司分析軟件自動計(jì)測每只大鼠的行走速度，記錄數(shù)值。

1.3 大鼠腦組織切片免疫熒光染色

各組大鼠水合氯醛麻醉后，迅速使用生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行灌注固定，梯度沉糖、脫水后，包埋劑充分包埋，進(jìn)行連續(xù)冠狀面的冰凍切片，片厚25 μm。將腦組織切片放入6孔板，0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min；經(jīng)0.01 mol/L PBST配制的10%的山羊血清室溫孵育30 min；分別加入兔抗大鼠酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)一抗(1∶2000, Millipore, 美國)；陰性對照加同體積的0.01 mol/L PBST，室溫孵育30 min后，置于4 ℃搖床過夜；0.01 mol/L PBS漂洗，5 min×3次；加入驢抗兔熒光二抗(1∶500, Invitrogen, 美國)，室溫孵育60 min；0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次； 70%甘油磷酸鹽緩沖液封閉；熒光顯微鏡下觀察、拍照并在40倍鏡下對黑質(zhì)(substantia nigra,SN)區(qū)TH(+)神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，鏡下記測4個不同視野的神經(jīng)元數(shù)量，取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 大鼠腦組織SN區(qū)蛋白表達(dá)的檢測

各組大鼠水合氯醛麻醉后，完整取出大鼠大腦組織，迅速在冰上使用采樣器準(zhǔn)確取出含有完整SN區(qū)的腦組織，加入組織裂解液，冰上充分研磨、裂解30 min，4℃；離心12000 r/min，20 min，取上清進(jìn)行蛋白電泳，300 mA穩(wěn)流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，1 h；10%的脫脂奶封閉，室溫2 h；用5%的脫脂奶稀釋TH(1∶2000, Millipore, 美國)和β-actin(1∶10000, Santa Cruz, 美國)的一抗，4 ℃，過夜；用TBST搖洗3次，每次10 min；用TBST稀釋二抗，稀釋比例為1∶10000，室溫?fù)u1 h，TBST搖洗3次，每次10 min；在膜的蛋白面滴加化學(xué)發(fā)光試劑1 min，置于UVP化學(xué)發(fā)光觀測系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行觀察測量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 魚藤酮對大鼠體重變化的影響

魚藤酮模型組大鼠造模期間體重明顯減輕，伴有拒捕行為減弱，弓背、豎毛、毛色發(fā)黃變臟，進(jìn)食量減少，動作遲緩，主動活動減少，部分大鼠出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)或不能直線行走。造模2周與3周后，模型組大鼠體重較各對照組大鼠體重顯著性下降(P<0.05,P<0.01)，各對照組大鼠間體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如表1所示。

2.2 魚藤酮對大鼠行為學(xué)檢測的影響

通過方橋?qū)嶒?yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)分別檢測了各組大鼠運(yùn)動功能的變化情況。方橋?qū)嶒?yàn)顯示(表2)，魚藤酮模型組大鼠造模2周和3周后，與對照組相比，方橋存留時間出現(xiàn)顯著性下降(P<0.01)；曠場實(shí)驗(yàn)顯示(表3)，魚藤酮模型組大鼠造模2周和3周后，與對照組相比，運(yùn)動速度顯著性減慢(P<0.01)；各對照組大鼠間行為學(xué)相關(guān)檢測差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。行為學(xué)檢測結(jié)果顯示，魚藤酮模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的運(yùn)動功能障礙。

表1 各組大鼠造模期間體重的變化(g)

注：與各對照組比較，*P<0.01，**P<0.05。

表2 各組大鼠方橋存留時間的變化(s)

注：與各對照組比較，**P<0.05。

表3 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)移動速度的變化(s)

注：與各對照組比較，**P<0.05。

2.3 魚藤酮致PD模型大鼠SN 區(qū)TH(+)細(xì)胞數(shù)目減少

通過免疫熒光檢測技術(shù)，我們檢測了各組大鼠SN 區(qū)TH(+)細(xì)胞的數(shù)目。如圖1所示，與對照組相比，魚藤酮模型組大鼠造模3周后，大鼠SN 區(qū)TH(+)細(xì)胞的數(shù)目顯著性下降(**P <0.01)；各對照組大鼠間SN 區(qū)TH(+)細(xì)胞的數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A：各組大鼠SN 區(qū)TH(+)細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果的變化(**P<0.01)；B：各組大鼠SN 區(qū)TH免疫熒光染色。

圖1 各組大鼠SN 區(qū)TH(+)細(xì)胞數(shù)目的變化情況

2.4 魚藤酮致PD模型大鼠SN 區(qū)TH蛋白表達(dá)水平下降

通過Western-blot檢測技術(shù)，我們檢測了各組大鼠SN 區(qū)TH蛋白表達(dá)水平的變化。如圖2所示，與對照組相比，魚藤酮模型組大鼠造模3周后，大鼠SN 區(qū)TH蛋白表達(dá)水平顯著性下降(P<0.01)；各對照組大鼠間SN 區(qū)TH蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A：各組大鼠SN 區(qū)TH蛋白表達(dá)水平；B：各組大鼠SN 區(qū)TH(+)蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的變化(**P<0.01)。

圖2 各組大鼠SN 區(qū)TH蛋白表達(dá)的變化情況

3 討 論

現(xiàn)今PD的致病因素和發(fā)病機(jī)制并未研究清楚，包括基因突變、環(huán)境因素等多種致病因素均參與其中，因此神經(jīng)毒性藥物模型在PD的相關(guān)研究過程中仍具有很廣闊的應(yīng)用范圍[7]。上世紀(jì)80年代，吸毒者在誤將1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)當(dāng)作杜冷丁類似物吸食后，出現(xiàn)了典型的PD相關(guān)癥狀，因此建立了以MPTP損傷導(dǎo)致的猴和小鼠的PD模型[8]。MPTP在體內(nèi)被B型單胺氧化酶催化，代謝產(chǎn)生l-甲基-4-苯基-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-tetrahydropyridine, MPP+)，通過MPP+抑制線粒體氧化呼吸鏈，并聚積在DA能細(xì)胞中形成大量NO自由基，致神經(jīng)細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致PD[9]。MPTP制備的靈長類模型在癥狀及病理、生化方面酷似人類的PD，且穩(wěn)定可靠，但費(fèi)用太高、管理不便使其難以廣泛應(yīng)用[10]。魚藤酮是從毛魚藤的液汁魚藤膠中分離出來的一種常用的殺蟲劑，具有親脂性，可透過血腦屏障，抑制胞內(nèi)線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性，產(chǎn)生與MPTP相似的作用，使呼吸鏈電子傳遞障礙，ATP合成減少，引發(fā)脂質(zhì)過氧化和自由基的產(chǎn)生，通過一系列的繼發(fā)反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。DA能神經(jīng)元對魚藤酮尤為敏感，可選擇性地直接進(jìn)入DA能神經(jīng)元發(fā)揮毒性作用，可能與DA能神經(jīng)元對氧化應(yīng)激高度敏感有關(guān)[12]。

前期Ferrante等報道大鼠持續(xù)10 d靜脈灌注10～18 mg/(kg·d)魚藤酮，大鼠出現(xiàn)了明顯的運(yùn)動障礙和僵住癥[13]；而Betarbet等報道，將微滲泵埋入Lewis大鼠背部皮下，通過下頜角靜脈插管連接微泵，以2～3 mg/(kg·d)灌注魚藤酮，5周后大鼠會出現(xiàn)身體屈曲、運(yùn)動減少伴強(qiáng)直、震顫[14]；Saravanan等報道，采用魚藤酮立體定向黑質(zhì)注射也可成功制作PD大鼠模型[15]；此外，還有研究應(yīng)用皮下以及腹腔注射不同劑量魚藤酮的方法制作PD大鼠模型[16]。大量的實(shí)驗(yàn)都證明魚藤酮致PD動物模型不僅會出現(xiàn)行為學(xué)改變，相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)會出現(xiàn)α突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)的聚積，甚而出現(xiàn)了LBs，比較好的模擬了PD病理變化的特點(diǎn)[17]。依據(jù)Braak提出的PD腦內(nèi)病理進(jìn)展分級學(xué)說，PD現(xiàn)今已不止被認(rèn)為是只影響SN區(qū)DA能神經(jīng)元的狹窄區(qū)域性病變，而被認(rèn)為是一種從延髓起始，逐漸向上影響到整個大腦皮層以及全身多個系統(tǒng)的廣泛性的病變[18]。魚藤酮動物模型對研究α-syn在PD發(fā)病過程中的作用，以及PD腦內(nèi)具體病變的順序都是必不可少的極好的動物模型。

然而以往的造模方法仍存在不少問題，限制了魚藤酮致PD大鼠模型的廣泛應(yīng)用，比如微泵靜脈給藥的方式費(fèi)用較為昂貴，立體定向注射的給藥方式操作比較復(fù)雜，而經(jīng)皮下給藥的方法模型成功率低，不夠穩(wěn)定可靠，而且以1∶1比例混合的DMSO與PEG為溶劑溶解魚藤酮，模型死亡率較高。因此，如果能找到一種方便易行的方法來建立魚藤酮致PD大鼠模型，將會為相關(guān)研究提供一種較有價值的動物模型，有助于PD相關(guān)研究的開展。

本實(shí)驗(yàn)采用雄性Wistar大鼠，使用1∶49的比例預(yù)先配制好DMSO和MCT混合物作為溶劑，連續(xù)3周通過腹腔注射魚藤酮。實(shí)驗(yàn)中通過體重監(jiān)測顯示，魚藤酮模型組大鼠在造模2周后，體重較各對照組大鼠明顯下降；而第1、2、3周末分別檢測大鼠的行為學(xué)改變，結(jié)果顯示，與各對照組大鼠相比，魚藤酮模型組大鼠方橋存留時間和移動速度在第2周和第3周均明顯下降；體重與行為學(xué)檢測相關(guān)變化均與魚藤酮注射的時程有關(guān)。而SN區(qū)免疫熒光和Western-blot檢測顯示，魚藤酮模型組大鼠較各對照組大鼠，SN區(qū)TH(+)神經(jīng)元數(shù)目和TH蛋白表達(dá)水平均明顯的下降，進(jìn)一步表明了魚藤酮模型組大鼠的行為學(xué)變化主要是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的受損和缺失所引起的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過使用魚藤酮MCT乳化液，有助于藥物的滲透；而中等劑量、中等時間長度的使用魚藤酮進(jìn)行造模，大大提高了模型的成功率。本實(shí)驗(yàn)中采用的魚藤酮PD大鼠模型制作方法，可行性強(qiáng)，模型更穩(wěn)定，且花費(fèi)較少，操作簡便。本研究為開展環(huán)境因素與PD的發(fā)生關(guān)系、PD的發(fā)病機(jī)制以及PD腦內(nèi)具體病變順序的研究，提供了一個適合且更為簡便的動物模型，同時為PD相應(yīng)的預(yù)防和神經(jīng)保護(hù)作用的研究提供了新的途徑。