張艷敏，劉 穎，李文通，楊亞嵐，葛長(zhǎng)利，陳其美，周 榮，李 奎

（1.山東藍(lán)思種業(yè)有限公司，山東日照 276800；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3. 佛山科技學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528231）

2008年圭爾夫大學(xué)的研究者利用酵母雙雜交技術(shù)在人腦cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)Luman/CREB3募集因子（Luman/CREB3 Recruiting Factor，CREBRF）[1]。研究發(fā)現(xiàn)，CREBRF基因在小鼠的不同組織、發(fā)情周期的不同階段以及卵巢顆粒細(xì)胞中呈現(xiàn)時(shí)空特性表達(dá)[2-3]，且在凋亡顆粒細(xì)胞中CREBRF蛋白與促凋亡蛋白CHOP、Caspase-12共表達(dá)，暗示CREBRF基因可能在卵泡選擇中發(fā)揮重要作用[3]。在敲除實(shí)驗(yàn)中，CREBRF基因敲除雌鼠的體內(nèi)激素分泌發(fā)生了顯著變化，生產(chǎn)后的母鼠表現(xiàn)出乳腺發(fā)育缺陷、母性行為缺失、無(wú)關(guān)行為活躍等現(xiàn)象[4]。最新研究也表明，CREBRF基因作為山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中自噬的潛在激活劑，雌二醇和孕酮能夠通過(guò)mTOR途徑增加CREBRF蛋白的表達(dá)，從而在前列腺素分泌和細(xì)胞附著中起著核心作用[5]。分析CREBRF基因缺陷型細(xì)胞顯示，裂解感染期間細(xì)胞內(nèi)的HSV-1基因表達(dá)和病毒產(chǎn)量顯著增加，說(shuō)明CREBRF蛋白可能通過(guò)隔離重要的輔助因子或感染所需的必需效應(yīng)因子對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用[6]。CREBRF基因還被證明是一種有效的膠質(zhì)瘤抑制劑，能夠阻斷CREB3/ATG5通路中缺氧誘導(dǎo)的自噬[7]。在薩摩亞人群中進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，CREBRF的一個(gè)突變體rs373863828與肥胖增加有關(guān)[8]，同時(shí)也能顯著降低Ⅱ型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)[9]。近十年的研究表明，CREBRF基因在機(jī)體代謝、疾病治療，尤其在哺乳動(dòng)物繁殖過(guò)程中扮演著重要角色。而目前關(guān)于CREBRF基因?qū)Σ溉閯?dòng)物繁殖過(guò)程的調(diào)控研究主要集中在小鼠上，且其中明確的生物學(xué)功能和分子機(jī)制報(bào)道還相對(duì)較少。因此，本文主要概述CREBRF基因及其對(duì)哺乳動(dòng)物繁殖調(diào)控的研究，有助于探索CREBRF基因的生物學(xué)功能。

1 CREBRF基因

1.1CREBRF發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特征 Luman募集因子因能夠與Luman蛋白的亮氨酸拉鏈樣區(qū)域結(jié)合而被命名，由加拿大圭爾夫大學(xué)研究人員利用酵母雙雜交技術(shù)在人腦的cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)。Luman是CREB家族的一個(gè)成員，又稱為CREB3，因此Luman募集因子（Luman/CREB3 Recruiting Factor，LRF）又可以縮寫(xiě)為CREBRF。CREBRF蛋白是一種未折疊蛋白應(yīng)答響應(yīng)亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，該基因編碼639個(gè)氨基酸，組成分子量為71.981 ku的蛋白分子，蛋白結(jié)構(gòu)包含1個(gè)高度酸性的區(qū)域，1個(gè)典型的bZIP區(qū)域和1個(gè)亮氨酸拉鏈樣的結(jié)構(gòu)域[1]。在人類和已研究的動(dòng)物中，CREBRF蛋白結(jié)構(gòu)極其保守，對(duì)人、小鼠、大鼠的CREBRF蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)小鼠和大鼠的氨基酸序列的同源性超過(guò)95%[1]。

1.2CREBRF在不同組織中的表達(dá)規(guī)律 目前對(duì)CREBRF基因的表達(dá)研究主要集中在小鼠上。研究表明，CREBRF基因在小鼠的脂肪、腦、腸、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、骨骼肌和睪丸中都有表達(dá)，其中在心臟和腎臟中的表達(dá)水平較高[1]。楊延周[3]對(duì)CREBRF基因的長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，CREBRF在卵巢的各級(jí)卵泡、凋亡的顆粒細(xì)胞中有不同程度表達(dá)。在小鼠發(fā)情周期的不同階段也呈現(xiàn)時(shí)空特異性表達(dá)模式，CREBRF基因在小鼠發(fā)情期間期的子宮和輸卵管以及發(fā)情后期的卵巢中表達(dá)水平較高[2,10]。此外，CREBRF在卵母細(xì)胞和早期胚胎中也有表達(dá)，CREBRF在4細(xì)胞期的胚胎與囊胚中的表達(dá)水平高于卵母細(xì)胞和其他發(fā)育階段的胚胎[2,10]。在小鼠胚胎植入初期的子宮腔上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞以及圍繞著胚胎的基質(zhì)細(xì)胞、子宮內(nèi)的初蛻膜區(qū)和次蛻膜區(qū)的著床部位，CREBRF都有較高水平的表達(dá)[11]。上述研究證明，CREBRF基因在小鼠生殖系統(tǒng)以及繁殖過(guò)程中呈現(xiàn)出不同的時(shí)空表達(dá)模式，表明其在發(fā)情周期、胚胎植入和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜中可能具有至關(guān)重要的生物學(xué)功能。但目前對(duì)CREBRF基因功能的報(bào)道甚少。

2 CREBRF蛋白的生物學(xué)功能及研究現(xiàn)狀

2.1 CREBRF與Luman CREBRF蛋白是一種重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)抑制Luman蛋白的轉(zhuǎn)錄激活而對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。Luman/CREB3是CREB家族的主要成員，CREB家族具有非常保守的bZIP區(qū)域及特異的疏水性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜區(qū)域的結(jié)構(gòu)基序。Luman是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的重要跨膜蛋白，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，Luman蛋白被類似調(diào)節(jié)ATF6的膜內(nèi)水解機(jī)制分裂，通過(guò)蛋白質(zhì)水解切割被釋放[12]，然后Luman N端蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而導(dǎo)致下游應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因活化[13-14]。Luman作為一種多功能蛋白，最初被鑒定為與單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV）相關(guān)的宿主細(xì)胞因子1（Host Cell Factor，HCF1）的相互作用蛋白[12]。除了參與HSV的潛伏和再激活，Luman還參與人類免疫缺陷基因調(diào)控[15]、白細(xì)胞遷移和功能發(fā)揮[16-17]、樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟[18]、糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)的傳導(dǎo)[19]等。CREBRF是Luman在哺乳動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）和未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded Protein Reaction，UPR）中的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，其提供亮氨酸序列的C端區(qū)域在與Luman亮氨酸拉鏈區(qū)域相結(jié)合后，促進(jìn)其降解，從而調(diào)節(jié)Luman表達(dá)，負(fù)反饋參與ERS[1]。CREBRF通過(guò)2個(gè)途徑來(lái)發(fā)揮加速抑制Luman蛋白的作用，一方面是隔離Luman到核小體，阻止其與HCF-1等反式激活必需的輔因子相結(jié)合；另一方面，CREBRF蛋白的半衰期只有 20 min，在細(xì)胞內(nèi)CREBRF蛋白的穩(wěn)定性受蛋白酶體的調(diào)節(jié)，其在蛋白酶體的作用下易于降解，因此Luman蛋白會(huì)隨著CREBRF蛋白的降解而降解，這也是繼 Luman 蛋白水解和入核活動(dòng)后CREBRF蛋白對(duì)Luman蛋白的另一種水平的調(diào)節(jié)[1]?？梢钥闯?，CREBRF和HCF-1 都是在核內(nèi)與Luman相互作用的蛋白，但HCF-1是普遍的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，是Luman轉(zhuǎn)錄激活必須的輔助因子，而CREBRF則是起到抑制Luman蛋白反式激活的作用[20-21]，兩者可能對(duì)Luman蛋白起到相反的調(diào)節(jié)作用。

2.2 CREBRF在糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)傳導(dǎo)中的作用CREBRF基因敲除雌性小鼠在哺乳期存在嚴(yán)重的母性行為缺失、乳腺發(fā)育缺陷以及糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid Receptors，GR）信號(hào)顯著增強(qiáng)等現(xiàn)象[4]。第1次分娩的CREBRF基因敲除母鼠除了挖掘和筑巢行為增強(qiáng)，照顧幼鼠相關(guān)的活動(dòng)明顯減少，由于母鼠母性缺失和疏于喂養(yǎng)導(dǎo)致80%的幼崽在出生后24 h內(nèi)相繼死亡，而如果剛出生的幼仔交由野生型哺乳期母鼠哺乳和照顧，幼鼠就會(huì)存活[4]。對(duì)幼鼠的看護(hù)和哺乳可以刺激乳汁分泌和母性行為，催乳素（Prolactin，PRL）是快速誘導(dǎo)母性行為發(fā)生的重要激素。野生型小鼠的血清中PRL在妊娠晚期顯著升高，產(chǎn)后第12天下降到產(chǎn)前的正常水平，而在CREBRF基因敲除母鼠產(chǎn)前和產(chǎn)后的血清中PRL明顯降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在初產(chǎn)泌乳期，CREBRF基因敲除雌鼠的乳腺導(dǎo)管末端分枝明顯少于野生型泌乳期小鼠，表明CREBRF可能是通過(guò)調(diào)節(jié)丘腦下部-垂體-性腺軸對(duì)內(nèi)分泌激素（如PRL等）的分泌起調(diào)控作用[4]。GR通過(guò)與PRL的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合對(duì)PRL的合成與分泌進(jìn)行下調(diào)，而CREBRF蛋白能夠抑制GR的轉(zhuǎn)錄活性并促進(jìn)其蛋白降解，在CREBRF基因敲除的哺乳期母鼠體內(nèi)，GR的分泌由于CREBRF蛋白的缺失而明顯升高，進(jìn)而抑制了PRL的合成和分泌，使得母鼠的母性行為減弱[4]。還有研究表明，在小鼠妊娠過(guò)程中，CREBRF蛋白的表達(dá)還會(huì)受到雌激素和孕酮的調(diào)控[22]，進(jìn)一步調(diào)節(jié)丘腦下部-垂體-性腺軸的作用，影響初產(chǎn)雌鼠對(duì)幼鼠的哺乳和照顧等母性行為，但是具體的生理調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

2.3 CREBRF在子宮蛻膜化中的作用 子宮蛻膜化即子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化與多核化而形成一種特殊組織的過(guò)程，對(duì)胚胎的著床、妊娠的建立與維持以及分娩的發(fā)動(dòng)都有著極為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠子宮中，CREBRF蛋白在基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化時(shí)顯著上調(diào)[11]，在基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步證明CREBRF基因被干擾后會(huì)導(dǎo)致子宮基質(zhì)細(xì)胞增殖受限，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)也發(fā)生異常[23]，暗示CREBRF可能在基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過(guò)程中發(fā)揮一定作用。在子宮蛻膜過(guò)程中，基質(zhì)細(xì)胞的一系列變化被不同的細(xì)胞周期因子所調(diào)控[24]。CREBRF基因被干擾后，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子cyclin A與cyclin B1的表達(dá)下降，引起細(xì)胞周期的S期阻滯，而細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子cyclin E與cyclin D3的mRNA表達(dá)并沒(méi)有明顯變化[25]。這可能是由于cyclin D3與cyclin E主要在細(xì)胞周期的G1期發(fā)揮作用，并不參與S期與G2/M期的細(xì)胞周期調(diào)控[26]。cyclin A和cyclin B作為周期蛋白依賴性激酶1（Cyclin-Dependent Kinase 1，Cdk1）的活化因子，兩者均在細(xì)胞周期G2/M期的有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且cyclin B1敲除能使胚胎致死[27]。但CREBRF影響細(xì)胞周期素cyclin A和cyclin B具體的分子調(diào)節(jié)通路仍需要進(jìn)一步探究。

2.4 CREBRF介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑在卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是機(jī)體合成蛋白的重要細(xì)胞器，真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)進(jìn)行正確地折疊以及成熟，然后根據(jù)功能不同將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上發(fā)揮功能或釋放到細(xì)胞外發(fā)揮調(diào)控作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊和成熟的效率是對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境與外界刺激的積極響應(yīng)，尤其是在分泌細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞中[28]，高質(zhì)量的蛋白折疊對(duì)細(xì)胞的功能、存活和正常的生理功能維持至關(guān)重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配、運(yùn)輸和降解來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，當(dāng)錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)又無(wú)法快速、正確地處理時(shí)（ERS），細(xì)胞內(nèi)某些相關(guān)的信號(hào)通路就會(huì)被激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生一系列的反應(yīng)（UPR），以加快內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白的正確折疊，維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)，或使細(xì)胞發(fā)生自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，UPR是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理蛋白折疊或降解的一種質(zhì)控機(jī)制，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激后引起的后續(xù)反應(yīng)[29-30]。UPR的生理學(xué)功能是維持精確的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白量進(jìn)行控制[31]。UPR活化可以促進(jìn)細(xì)胞存活，但在機(jī)體環(huán)境異常情況下，ERS和UPR均無(wú)法處理這些未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白時(shí)，機(jī)體就會(huì)啟動(dòng)凋亡程序[32]，進(jìn)而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[33-36]。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育是相互協(xié)調(diào)和相互依賴的過(guò)程，顆粒細(xì)胞具有芳香化酶活性[37]，通過(guò)產(chǎn)生雌激素對(duì)卵泡生長(zhǎng)和排卵起著重要的作用[38]，其功能障礙可能導(dǎo)致不育[39-40]。近年來(lái)的研究表明，ERS可能誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡[41-42]，進(jìn)而引起卵泡閉鎖[43]。在缺氧、代謝異常、營(yíng)養(yǎng)不足或過(guò)剩等異常情況下，機(jī)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)[44]，然后通過(guò)ERS和UPR途徑引起顆粒細(xì)胞凋亡，卵泡隨之發(fā)生閉鎖，異常高的閉鎖會(huì)導(dǎo)致慢性不孕和/或過(guò)早終止生育[45]。Luman是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)起著重要的調(diào)節(jié)作用，而CREBRF蛋白能夠抑制Luman的活性，負(fù)反饋調(diào)節(jié)ERS和UPR[1,46]。目前研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞及原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和成熟卵泡中均檢測(cè)到CREBRFmRNA和CREBRF蛋白，提示CREBRF可能通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖和分化，乃至凋亡，進(jìn)而參與卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟及排卵等過(guò)程。

3 總結(jié)及展望

CREBRF基因在機(jī)體代謝、疾病治療，尤其在哺乳動(dòng)物繁殖調(diào)控過(guò)程中的生物學(xué)功能已有初步報(bào)道。家畜的繁殖性能在很大程度上影響著現(xiàn)代規(guī)?；r(nóng)業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，因此探究哺乳動(dòng)物繁殖過(guò)程中精確的分子機(jī)制是研究者和生產(chǎn)者一直致力于解決的問(wèn)題。已有研究表明，機(jī)體在某些異常情況下的ERS和UPR會(huì)誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞的異常凋亡，而在原始卵泡發(fā)育到成熟卵泡的過(guò)程中，在顆粒細(xì)胞中檢測(cè)到CREBRF基因和蛋白表達(dá)，暗示CREBRF可能通過(guò)ERS途徑對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡有抑制作用?？傊?，在卵泡選擇、子宮蛻膜化或植入等方面，CREBRF基因都有著潛在的重要功能，明確其在動(dòng)物繁殖過(guò)程中的具體生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制，可為高繁殖力家畜的選育工作確定新的輔助靶標(biāo)，提高現(xiàn)代畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。