楚 曉,周 超,王偉青,向 明,劉 輝

(1復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院胸外科,上海 200240;2上海市胸科醫(yī)院，上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院胸外科;*通訊作者,E-mail:jesus8@163.com)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的大部分,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。近幾年來肺癌的靶向治療得到飛速發(fā)展,成為肺癌治療的有效方案[1]。但目前靶向治療的靶點較少[2]。因此,尋找更多的治療靶點基因,對于肺癌的治療具有重要意義。

實體腫瘤的快速生長會形成缺氧環(huán)境,而缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是促進腫瘤血管形成,使腫瘤細胞得以存活和生長的關(guān)鍵因子[3]。研究發(fā)現(xiàn),HIF本身并不能直接感受氧分壓的變化,而脯氨酰酸羥化酶(prolyl hydroxylase,PHD)才是真正直接感受氧分壓的分子,并對保持HIF-1α數(shù)量的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用[4]?，F(xiàn)己證實,在哺乳動物細胞中有三種類似的酶PHDl、PHD2和PHD3,有研究認為PHD3可能在較重程度缺氧或長時間缺氧時發(fā)揮調(diào)節(jié)HIF-1α的作用[5]。故本研究提出假設(shè):在缺氧狀態(tài)非小細胞肺癌細胞中,PHD3隨著缺氧狀態(tài)的加重而表達升高,通過正向調(diào)控HIF-1α的表達,進而促進腫瘤生長。為了驗證上述假說,本研究首先建立缺氧狀態(tài)非小細胞肺癌細胞模型,觀察不同缺氧程度下PHD3、HIF-1α的表達變化;改變該模型中PHD3的表達水平,觀察PHD3對HIF-1α表達的調(diào)控作用及對其生物學(xué)特性的影響,旨在為非小細胞肺癌靶向治療提供新的潛在靶點。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

A549細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫。BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所),HRP-羊抗兔二抗、HRP-羊抗鼠二抗(美國Jackson),DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),Annexin Ⅴ凋亡檢測試劑盒(美國BD),RNA提取試劑盒(中國TAKARA),SYBR GREEN kit、RT-PCR反應(yīng)膜(美國ABI),CoCl2(中國國藥集團化學(xué)試劑公司),GAPDH抗體、HIF-1α抗體、PHD3抗體、PKM2抗體(美國Proteintech),PHD3-siRNA(上海拓然生物科技有限公司),Transwell小室、基質(zhì)膠(美國Corning)。

1.2 A549細胞缺氧模型建立

A549細胞培養(yǎng)在DMEM+10%胎牛血(FBS)+1%雙抗的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37 ℃,5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱。細胞計數(shù)板計數(shù),6孔板中每孔2×105個細胞。37 ℃,5% CO2培養(yǎng),細胞培養(yǎng)過夜。加終濃度為200 μmol/L的氯化鈷(CoCl2)分別處理12 h和24 h,并設(shè)立對照組。加RIPA裂解液收集蛋白,用于后續(xù)實驗。

1.3 Western blot檢測PHD3、HIF-1α蛋白表達

收集缺氧培養(yǎng)的A549細胞及轉(zhuǎn)染或siRNA干擾處理結(jié)束后的各組細胞,用RIPA裂解液裂解,提取細胞總蛋白。BCA法測定各組樣本蛋白濃度,沸水浴變性處理后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜上,10%脫脂奶粉溶液封閉,分別加入相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育45 min。ECL顯影，暗室曝光。

1.4 免疫細胞化學(xué)檢測PHD3、HIF-1α蛋白表達

胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養(yǎng)基中,制備單細胞懸液,計數(shù),37 ℃,5% CO2培養(yǎng)過夜。終濃度為200 μmol/L的CoCl2分別處理12 h和24 h。吸除培養(yǎng)基,PBS洗滌,4%多聚甲醛(PBS配制)固定20 min,使用PBS洗滌細胞除去多聚甲醛。0.5% Triton X-100(PBS配制)室溫孵育20 min,內(nèi)源性過氧化物酶處理:3% H2O2孵育,用10%的與二抗同源的血清(PBS配制)封閉30 min,一抗4 ℃孵育過夜，滴加足夠量適宜濃度的羊抗兔二抗(1 ∶1 000)，37 ℃，30 min。DAB顯色，蘇木素染色復(fù)染核，中性樹膠封片。

1.5 PHD3過表達質(zhì)粒構(gòu)建

通過基因合成獲得目的片段插入到載體pUC57-Amp,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,取感受態(tài)細胞,冰上融化,將重組的產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中冰浴30 min,42 ℃熱激75 s，冰浴3 min,加入800 μl LB培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)1 h，4 000 r/min離心5 min，去上清,將沉淀全部均勻涂到含有氨芐青霉素的平板上,過夜培養(yǎng)等菌落形成。小量提取質(zhì)粒(挑取單克隆過夜培養(yǎng),取過夜培養(yǎng)的菌液,加入離心管中,12 000 r/min離心1 min,盡量吸除上清。依次向留有菌體沉淀的離心管中加入溶液P1,P2,P3,使菌體充分裂解,最終出現(xiàn)白色絮狀沉淀。將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱中,12 000 r/min離心60 s,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放入收集管中,依次加入去蛋白液PD,漂洗液PW,并分別離心、去掉廢液、再離心后,將吸附柱開蓋,置于室溫放置數(shù)分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液,將吸附柱置于一個干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位滴加洗脫緩沖液EB,室溫放置2 min,12 000 r/min離心2 min,將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。測序鑒定后,將提取的質(zhì)粒pUC57-BX647792和載體PCDNA3.1通過Hind Ⅲ/XhoⅠ酶切過夜,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒切膠回收,4 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,通過酶切鑒定后,質(zhì)粒提取試劑盒大提質(zhì)粒,-20 ℃保存。

1.6 PHD3過表達的A549細胞制備

胰酶消化處理細胞,離心,計數(shù)。細胞接6孔細胞培養(yǎng)板,用250 μl Opti-MEM稀釋1 000 ng質(zhì)粒,吹吸混勻,輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑,用250 μl Opti-MEM稀釋10 μl LipofectamineTM2000,輕吹吸混勻,室溫靜置5 min?；旌限D(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒稀釋液,吹吸混勻,室溫靜置20 min。轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔板中,轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基,細胞板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收取細胞用于RT-PCR和Western blot實驗檢測過表達效果。

1.7 siRNA法制備PHD3低表達的A549細胞

胰酶消化處理細胞,離心,計數(shù),細胞接6孔細胞培養(yǎng)板,用250 μl Opti-MEM稀釋siRNA(轉(zhuǎn)染細胞的終濃度為100 nmol/L),輕輕吹吸混勻。輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑,用250 μl Opti-MEM稀釋10 μl LipofectamineTM2000,輕輕吹吸混勻,室溫靜置5 min。混合siRNA稀釋液,輕輕吹吸混勻,室溫靜置20 min。轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔細胞板中,500 μl/孔,前后輕搖細胞板混合均勻。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。收取細胞用于RT-PCR和western blot實驗檢測沉默效果。

1.8 real-time PCR檢測PHD3、HIF-1α基因表達

收集各組細胞,使用總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA,并通過反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA樣本,根據(jù)人PHD3、HIF-1α基因序列和內(nèi)參β-actin序列,使用Primerpremier 5.0軟件設(shè)計相應(yīng)引物。取上述cDNA產(chǎn)物作為模板,采用real-time PCR,檢測HIF-1α基因表達。

1.9 CCK-8法檢測細胞增殖能力

細胞棄去細胞培養(yǎng)基,胰酶消化后,離心棄上清。細胞計數(shù)板計數(shù),鋪板。96孔板中每孔1×104個細胞,轉(zhuǎn)染siRNA或PHD3過表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染6 h后,每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 450 nm測量吸光值。計算細胞增殖活力。

1.10 Transwell細胞遷移實驗檢測細胞遷移能力

細胞鋪6孔板,每孔2×105個細胞。細胞計數(shù)板計數(shù),用含有1%FBS的DMEM培養(yǎng)基制備細胞懸液,調(diào)整細胞至5×105個/ml。10% FBS的培養(yǎng)基置于細胞培養(yǎng)皿的下室,每孔600 μl。在上孔準確加入1×105個細胞/孔,細胞懸液體積200 μl。置于37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)時間結(jié)束后,棄去上室液體,小心取出上室,用濕棉簽擦去未穿過膜的細胞。4%中性甲醛固定10 min,結(jié)晶紫染色10 min,PBS洗3次,干燥,直接取下小室,顯微鏡下檢測穿過膜的細胞(200×)。

1.11 Transwell細胞侵襲實驗檢測細胞侵襲能力

無菌條件下取出稀釋好的基質(zhì)膠,冰浴融化,加入到(24孔)聚碳酸酯膜上,37 ℃放置至膠完全凝固。每孔加入200 μl培養(yǎng)基使膠重構(gòu)。將10%FBS的培養(yǎng)基置于細胞培養(yǎng)皿的下室,制備好的細胞懸液,調(diào)整細胞至5×105個/ml,在上孔準確加入1×105個細胞/孔,細胞懸液體積200 μl。置于37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去上室液體,小心取出上室,用濕棉簽擦去未穿過膜的細胞。4%中性甲醛固定10 min,結(jié)晶紫染色10 min,取下小室,顯微鏡下檢測穿過膜的細胞(200×)。每張膜的中央部分和邊緣部分各隨機取3個視野,計算每個視野內(nèi)的細胞數(shù)。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 缺氧狀態(tài)A549細胞中PHD3和HIF-1α的表達

建立A549細胞缺氧模型,模擬非小細胞肺癌腫瘤內(nèi)部缺氧狀態(tài),并通過Western blot檢測了缺氧狀態(tài)下的肺癌細胞中PHD3和HIF-1α的表達。缺氧A549細胞中HIF-1α的表達水平隨著缺氧時間延長而增加,而PHD3的表達隨著缺氧時間的延長而降低(見圖1A)。免疫細胞化學(xué)染色顯示,缺氧A549細胞中PHD3的表達水平降低(見圖1B)。

2.2 缺氧狀態(tài)A549細胞中PHD3的過表達及低表達對HIF-1α的調(diào)控

通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染建立PHD3的過度表達的缺氧培養(yǎng)A549細胞模型(見圖2A),通過siRNA干擾建立PHD3的低表達的缺氧培養(yǎng)A549細胞模型(見圖2B)。PHD3的過表達顯著抑制HIF-1α的表達(見圖3A),抑制PHD3表達可增加HIF-1α的表達(見圖3B)。

圖1 缺氧狀態(tài)A549細胞中PHD3和HIF-1α的表達Figure 1 The expression of PHD3 and HIF-1α in hypoxic A549 cells by Western blot and immunohistochemistry

2.3 PHD3的過表達及低表達對肺癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響

與對照相比,在缺氧條件下過表達PHD3的A549肺癌細胞的增殖,侵襲顯著降低(P<0.05,見圖4)。與對照相比,在缺氧條件下低表達PHD3的A549肺癌細胞的增殖,遷移和侵襲顯著增加(P<0.01,見圖5)。

3 討論

缺氧與許多癌癥(包括肺癌)的預(yù)后和腫瘤控制有關(guān)[6]。本研究探討了在非小細胞肺癌中,PHD3表達對HIF-1α表達的影響,以及PHD3的表達變化對非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549的細胞生物學(xué)特性,以研究PHD3在非小細胞肺癌中的作用機制和作為靶向治療靶點的潛力。CoCl2是一種缺氧模擬劑,通常用于體外誘導(dǎo)缺氧[7]。用CoCl2處理A549細胞后,HIF-1α的表達顯著增加,而PHD3的表達相對降低。這與之前的研究[8-10]一致,表明本試驗中的非小細胞肺癌細胞缺氧模型的構(gòu)建是成功的。PHD3作為氧感受器,對腫瘤微環(huán)境中的缺氧狀態(tài)非常敏感,當(dāng)腫瘤微環(huán)境中氧濃度下降后,PHD3的活性受到抑制,HIF-1α無法被羥基化,從而對HIF-1α的誘導(dǎo)分解降低,導(dǎo)致HIF-1α的大量累積,從而結(jié)合HIF-1β,進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能,在非小細胞肺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等方面發(fā)揮重要的作用[11,12]。HIF-1α由于缺氧時脯氨酰羥化酶(PHD)活性降低而積累,通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑與c-Myc相互作用以控制細胞周期[13]。HIF-1α還調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的遷移[14]。此外,已經(jīng)證明抑制HIF-1α表達可以減少非小細胞肺癌NCI-H157細胞的增殖和侵襲[15]。已發(fā)現(xiàn)PHD3表達增加通過多種機制抑制細胞增殖,包括EGFR調(diào)節(jié)[16]和HIF-1信號傳導(dǎo)[17]。本研究結(jié)果提示,HIF-1α的表達與非小細胞肺癌耐受缺氧環(huán)境,維持腫瘤的存活和生長密切相關(guān),并且作為重要的氧感受器和HIF-1α的重要調(diào)節(jié)器,PHD3過度表達,抑制了HIF-1α的表達,PHD3低表達時,HIF-1α的表達明顯增強,同時對非小細胞肺癌細胞的生物學(xué)特性也產(chǎn)生明顯影響:在缺氧條件下的A549細胞在PHD3過表達時,增殖、遷移和侵襲顯著降低(P<0.05);在PHD3低表達時,增殖、遷移和侵襲顯著增加(P<0.01)。

Con:對照組;NC:陰性對照;與Con組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

圖3 過表達或低表達PHD3的A549細胞中HIF-1α的表達Figure 3 Expression of HIF-1α in A549 cells after over-expression or low expression of PHD3

Con:對照組;NC:陰性對照;與對照(Con)組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

Con:對照組;NC:陰性對照;與對照(Con)組比較,*P<0.05,**P<0.01

綜上所述,PHD3的表達變化能夠影響非小細胞肺癌的HIF-1α基因的表達,同時對腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)特性產(chǎn)生重要影響,因而PHD3可能成為非小細胞肺癌靶向治療的新的潛在的靶點。