劉 萍,朱小華

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院眼科,長沙 410011;*通訊作者,E-mail:liuhandongdd@sina.com)

視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞屬于視網(wǎng)膜血管性疾病之一,好發(fā)于中老年人群,主要發(fā)病原因?yàn)橐暰W(wǎng)膜靜脈系統(tǒng)形成血栓所導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管性異常[1-3]。視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞患者的并發(fā)癥中以黃斑水腫最為常見,嚴(yán)重可導(dǎo)致患者喪失視力。1989年,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被首次分離提純,研究發(fā)現(xiàn)其在新生血管的形成過程中扮演重要角色,可通過結(jié)合其特異性受體,對病理及生理狀態(tài)下的血管生成產(chǎn)生影響[4,5]。隨著研究的不斷深入,研究人員指出,VEGF及其受體家族除了參與新生血管形成過程外,還與機(jī)體神經(jīng)功能、心肌缺血以及腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理過程及病理的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[6-8]。近年來,康柏西普、貝伐單抗以及雷珠單抗等多種VEGF抑制劑已經(jīng)逐漸應(yīng)用于腫瘤的治療中并取得較好的臨床效果,為此,本研究以視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞伴黃斑水腫患者為研究對象,通過探討可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1(sVEGFR-1)、可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-2(sVEGFR-2)與該疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性,旨在為視網(wǎng)膜新生血管相關(guān)疾病的臨床治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017-06～2017-12我院就診的視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫患者30例為病例組(n=30),選取同期入院體檢的健康人員30例作為對照組(n=30)。根據(jù)黃斑水腫程度及范圍將30例病例組受試者分為局限性黃斑水腫組(n=10)、彌漫性黃斑水腫組(n=10)、黃斑囊樣水腫組(n=10)。入組標(biāo)準(zhǔn):①符合視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞診斷標(biāo)準(zhǔn),且伴黃斑水腫者;②年齡20-45歲,性別不拘;③未曾接受過眼內(nèi)手術(shù)及眼底激光治療者;④未曾接受過玻璃體腔內(nèi)注射者;⑤臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn):①其他疾病引起的黃斑水腫患者;②大面積無灌注區(qū)及黃斑缺血患者;③存在青光眼病史患者;④嚴(yán)重精神類疾病患者。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且受試者均已簽署書面知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 受試者的分組 根據(jù)黃斑水腫程度及范圍將30例視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫患者分為局限性黃斑水腫組(n=10)、彌漫性黃斑水腫組(n=10)、黃斑囊樣水腫組(n=10)。

1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法測定血清sVEGFR-1、sVEGFR-2 mRNA水平 PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s;65 ℃ 45 s;80 ℃ 5 s,循環(huán)39次。溶解曲線:75-95 ℃,增量0.5 ℃,5 s。每次反應(yīng)均需要設(shè)置陰性對照,內(nèi)參為磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。內(nèi)參擴(kuò)增條件為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s;80 ℃ 5 s;循環(huán)39次。溶解曲線:75-95 ℃,增量0.5 ℃,5 s。全部引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)并合成,sVEGFR-1、sVEGFR-2的物序列見表1;應(yīng)熒光定量PCR儀(型號:BIO-RADCFX96,美國)進(jìn)行測定,并采用計(jì)算機(jī)軟件對樣本的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析(見表1)。

表1 sVEGFR-1、sVEGFR-2的引物序列Table 1 Primer sequences of sVEGFR-1 and sVEGFR-2

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定血清sVEGFR-1、sVEGFR-2蛋白表達(dá)水平 抽取受試者晨起空腹?fàn)顟B(tài)下的肘靜脈血2 ml,室溫條件下靜置1 h,采用低溫高速離心機(jī)以12 000×g的轉(zhuǎn)速條件離心15 min,取上層血清,保存于-70 ℃條件下。采用ELISA法測定血清中sVEGFR-1、sVEGFR-2蛋白水平,操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,ELISA試劑盒購自美國R&D System公司。全部待測樣本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔并于同一批次進(jìn)行測定,最終濃度為三次測定的平均值,批內(nèi)變異不超過5%,全部檢測均由經(jīng)驗(yàn)豐富的專人進(jìn)行檢測。

1.2.4 觀察指標(biāo) ①比較局限性黃斑水腫組、彌漫性黃斑水腫組、黃斑囊樣水腫組三組受試者性別、年齡等基線資料。②比較病例組、對照組受試者血清sVEGFR-1和sVEGFR-2的mRNA與蛋白表達(dá)水平。③局限性黃斑水腫組、彌漫性黃斑水腫組、黃斑囊樣水腫組三組受試者血清sVEGFR-1 mRNA和sVEGFR-2 mRNA與蛋白表達(dá)水平。④采用Logistic多因素回歸分析視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫與其血清sVEGFR-1、sVEGFR-2表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三組受試者基線資料

局限性黃斑水腫組、彌漫性黃斑水腫組、黃斑囊樣水腫組患者的眼底影像學(xué)見圖1。局限性黃斑水腫組、彌漫性黃斑水腫組、黃斑囊樣水腫組三組受試者年齡、性別等基線資料無顯著差異(P>0.05,見表2),故可排除上述因素對研究結(jié)果造成的影響,數(shù)據(jù)具有可比性。

表2 三組受試者基線資料比較Table 2 Comparison of baseline data between three groups of subjects

2.2 病例組、對照組受試者血清sVEGFR-1、sVEGFR-2的mRNA水平以及蛋白表達(dá)水平比較

病例組受試者血清sVEGFR-1 mRNA水平和sVEGFR-1蛋白明顯高于對照組、血清sVEGFR-2 mRNA水平和sVEGFR-2蛋白明顯高于對照組,兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3)。

表3 病例組、對照組受試者血清sVEGFR-1、sVEGFR-2的mRNA及蛋白水平比較Table 3 Comparison of mRNA and protein levels of serum sVEGFR-1 and sVEGFR-2 in case group and control

2.3 三組受試者血清sVEGFR-1 mRNA、sVEGFR-2 mRNA水平以及sVEGFR-1、sVEGFR-2蛋白表達(dá)水平

黃斑囊樣水腫組受試者血清sVEGFR-1 mRNA、sVEGFR-2 mRNA以及sVEGFR-1、sVEGFR-2蛋白表達(dá)水平明顯高于局限性黃斑水腫組、彌漫性黃斑水腫組,彌漫性黃斑水腫組受試者明顯高于局限性黃斑水腫組,三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表4)。

表4 三組受試者血清sVEGFR-1、sVEGFR-2 mRNA水平比較Table 4 Comparison of serum sVEGFR-1, sVEGFR-2 mRNA levels between three

2.4 血清sVEGFR-1、sVEGFR-2水平與視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫的線性相關(guān)分析

線性相關(guān)分析結(jié)果顯示,血清sVEGFR-1蛋白、sVEGFR-2蛋白表達(dá)水平與視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞伴黃斑水腫顯著相關(guān)(P<0.05,見表5)。

表5 血清sVEGFR-1、sVEGFR-2水平與視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞伴黃斑水腫的相關(guān)性Table 5 Correlation between sVEGFR-1,sVEGFR-2 and retinal branch vein occlusion with macular edema

3 討論

視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞患者伴黃斑水腫可對血-視網(wǎng)膜屏障造成損傷,增加機(jī)體的血管滲透性,視網(wǎng)膜實(shí)質(zhì)層內(nèi)滲透進(jìn)原本處于血漿中的多種蛋白,導(dǎo)致組織缺血缺氧,疾病進(jìn)一步進(jìn)展后會(huì)損傷視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞,且此種傷害是不可逆轉(zhuǎn)的,最終導(dǎo)致患者視功能的嚴(yán)重惡化甚至完全失明[9,10]。因此,探尋視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者伴黃斑水腫的影響因素,從而采取有針對性的防治措施改善患者視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài)、促進(jìn)其黃斑水腫的吸收尤為重要。近年來,研究人員提出VEGF在視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,因視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞患者是由于血液回流所導(dǎo)致的視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài),患者視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF表達(dá)水平增加,對新生血管形成產(chǎn)生影響,從而使得視網(wǎng)膜血管的通透性增加,存在視網(wǎng)膜下的滲液最終可引發(fā)黃斑水腫[11-13]。

作為重要的血管內(nèi)皮細(xì)胞促血管生長因子,VEGF的作用包括增加小靜脈、微靜脈的通透性,并對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分裂以及Ca2+在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的聚集過程進(jìn)行促進(jìn)[14,15]。常見的VEGF受體(VEGFR)主要包括下列三種:VEGFR-1、VEGFR-2以及VEGFR-3,三者同為酪氨酸激酶受體,其中VEGFR-1、VEGFR-2及其相結(jié)合的受體可對VEGF的活性進(jìn)行控制,通過對其受體的自身磷酸化過程進(jìn)行誘導(dǎo),使得相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活最終發(fā)揮生物學(xué)活性。sVEGFR-1主要分泌于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞,由VEGFR-1胞外域剪接而成,具有可分泌性,且對VEGF有高度的親和力,與sVEGFR-2同為VEGF跨膜受體的可溶形式。sVEGFR-1僅具有胞外配體結(jié)合區(qū),缺乏跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū),不具備酪氨酸激酶活性[16]。但由于sVEGFR-1還可與VEGFR-1、VEGFR-2相結(jié)合,即sVEGFR-1能夠?qū)EGF起到拮抗作用并對其生物學(xué)活性進(jìn)行阻斷，sVEGFR-1與VEGF結(jié)合后可抑制VEGF促血管生長的作用[17];sVEGFR-2屬于VEGF的酪氨酸激酶受體,在血管形成中扮演著主要信號傳遞體的作用,sVEGFR-2的趨化作用及促有絲分裂活性十分明顯,活化后能夠?qū)е卵軆?nèi)皮細(xì)胞發(fā)生分裂、增殖與遷移[18]。sVEGFR-1在先兆子癇、冠狀動(dòng)脈慢血流、糖尿病周圍神經(jīng)病變等多種疾病患者體內(nèi)表達(dá)異常[19,20],而在視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫方面未見報(bào)道。本文研究發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫患者血清sVEGFR-1 mRNA、sVEGFR-2 mRNA含量及其蛋白表達(dá)水平明顯高于健康人群,通過Logistic多因素回歸分析發(fā)現(xiàn),血清sVEGFR-1、sVEGFR-2表達(dá)水平與視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞伴發(fā)黃斑水腫顯著相關(guān)。

視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞伴黃斑水腫嚴(yán)重程度的影響因素主要包括以下幾方面:發(fā)病年齡、發(fā)生部位、靜脈阻塞的類型、黃斑靜脈引流影響情況等,患者視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞的部位與嚴(yán)重程度直接影響到患者視力的預(yù)后。視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞患者血-視網(wǎng)膜內(nèi)外屏障受損,當(dāng)病變累及至黃斑區(qū)時(shí),細(xì)胞外液積在黃斑區(qū)視網(wǎng)膜內(nèi)核層以及Henle纖維間存在,外觀為多囊樣;同時(shí)回流的視網(wǎng)膜內(nèi)層液體障礙會(huì)造成Müller細(xì)胞發(fā)生腫脹。當(dāng)黃斑水腫存在較長時(shí)間后,可損傷患者黃斑部的解剖結(jié)構(gòu)。相對于彌漫性黃斑水腫及黃斑囊樣水腫患者,局限性黃斑水腫患者中心凹處P1波振幅密度更高,提示由此可以看出,相較于局限性黃斑水腫與彌漫性黃斑水腫,黃斑囊樣水腫最為嚴(yán)重,且對視功能的損傷最大。本研究中,黃斑囊樣水腫組受試者血清sVEGFR-1 mRNA、sVEGFR-2 mRNA、蛋白表達(dá)水平明顯高于局限性黃斑水腫組、彌漫性黃斑水腫組,彌漫性黃斑水腫組明顯高于局限性黃斑水腫組,提示視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞患者所伴發(fā)的黃斑水腫程度越嚴(yán)重,其血清VEGF濃度越高,sVEGFR-1、sVEGFR-2表達(dá)水平越高。

綜上所述,視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫患者血清sVEGFR-1、sVEGFR-2表達(dá)水平明顯升高,且患者黃斑水腫程度越嚴(yán)重,其血清sVEGFR-1、sVEGFR-2表達(dá)水平越高。